МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
|
Оптическая микроскопия
|
|
ОФС.1.2.1.0009
|
|
|
|
Взамен ОФС.1.2.1.0009.15
|
Оптической микроскопией называют совокупность методов исследования частиц фармацевтических образцов лекарственных средств, невидимых невооруженным глазом, с помощью оптического микроскопа.
Размер частиц, которые могут быть исследованы данным методом, определяется разрешающей способностью микроскопа и обычно составляет 1 мкм и более. Используют также микроскопы с общим увеличением более 1500 крат, что позволяет характеризовать объекты размером от 0,5 мкм с разрешением отдельных структур объекта до 0,1 мкм.
Область применения
Оптическую микроскопию применяют:
- в фармакопейном анализе для определения размера частиц при контроле качества мягких лекарственных форм, суспензий, эмульсий, аэрозолей;
- в технологии лекарственных форм для определения степени измельчения фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ;
- для исследования кристаллической структуры фармацевтических субстанций;
- для определения характеристик (формы и размера) частиц фармацевтических субстанций, которые не являются сферическими (не имеют сферическую форму).
Оборудование
Оптический микроскоп имеет двухступенчатую систему увеличения, образованную объективом и окуляром. Все узлы микроскопа монтируются на массивном основании. На основании микроскопа установлен трубодержатель, в котором укреплён тубус с объективом и окуляром. Под объективом находится предметный столик, под которым расположена осветительная система (зеркало, коллектор, конденсор).
Для освещения объекта наблюдения может быть использован как естественный свет, так и специальные источники света (встроенные или внешние осветители).
Микроскоп может быть снабжён дополнительными приспособлениями (фазово-контрастными устройствами, конденсорами тёмного поля, поляризаторами, анализаторами и др.) и, в зависимости от выбранного метода исследования, может быть светлопольным, тёмнопольным, фазово-контрастным, поляризационным и др.
Испытуемый образец помещают на предметный столик. Свет от источника света, проходя через осветительную систему, испытуемый образец (далее – образец) и объектив, попадает в окуляр или установленную вместо него систему регистрации, фото- или видеокамеру. Через окуляр осуществляют визуальное исследование образца, а соединённая с компьютером цифровая фото- или видеокамера позволяет регистрировать изображения образца, после чего их можно обрабатывать по специальным программам в полу- или полностью автоматическом режиме.
Условия калибровки и измерения
Увеличение микроскопа (произведение увеличений объектива, окуляра и дополнительных приставок) должно быть достаточным для адекватного описания и определения размеров самых мелких частиц испытуемого образца.
Для каждого диапазона увеличения следует выбирать максимальную числовую апертуру объектива. Для контроля контрастности и детализации изображения окрашенных образцов необходимо использовать цветные фильтры с относительно узким спектром пропускания. Цветные фильтры могут применяться и для ахроматических (бесцветных) образцов.
Настройку всех элементов оптической системы и фокусировку проводят в соответствии с прилагаемой к микроскопу инструкцией. Калибровку проводит сертифицированная специализированная организация.
Методика
Испытуемые образцы исследуют с использованием или без использования иммерсионной жидкости. Природа применяемой иммерсионной жидкости в значительной степени определяется физическими свойствами испытуемого образца, который не должен в ней растворяться. В качестве иммерсионной жидкости при исследовании фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ, если нет других указаний в фармакопейной статье, используют минеральные масла: вазелиновое масло, иммерсионное масло для микроскопии классическое или профессиональное, водный раствор глицерина и др.
Частицы порошка должны находиться в одной плоскости и должны быть диспергированы так, чтобы были видны отдельные частицы (недопустимо слипание частиц).
При приготовлении образца для микроскопии (в том числе, при диспергировании в иммерсионной жидкости) должны быть сохранены первоначальный размер частиц и их распределение по размерам, свойственные испытуемому образцу.
Лекарственные формы анализируют без разведения или разводят, как указано в фармакопейной статье.
При исследовании порошков от 5 мг до 100 мг порошка суспендируют в подходящем объёме, например, 10 мл иммерсионной жидкости, добавляя при необходимости смачивающий агент (поверхностно-активные вещества).
На предметное стекло в счётное поле микроскопа помещают 1–2 капли полученной гомогенной суспензии, содержащей не менее 10 мкг вещества.
Предел размера частиц и допустимое количество частиц, превышающее этот предел, для каждой фармацевтической субстанции указан в фармакопейной статье или определяется в зависимости от задач проводимых испытаний.
Анализ лекарственных форм (по показателю «Размер частиц») проводят, как указано в соответствующей фармакопейной статье.
Определение кристаллического состояния вещества. Если не указано иное, испытуемый образец в минеральном масле помещают на предметное стекло и исследуют при помощи поляризационного микроскопа: при вращении предметного столика частицы проявляют двойное лучепреломление (демонстрируют интерференционную окраску) и положение экстинкции (поглощение и рассеяние света).
Фотографирование объекта. При необходимости фотографирования объекта используют цифровую фото- или видеокамеру, соединённую с компьютером с установленным программным обеспечением.
Испытуемый образец нужно чётко сфокусировать на плоскости фотоэмульсии; затем определить фактическое увеличение с помощью калиброванного объект – микрометра, используя фотопленку с достаточной светосилой, разрешающей способностью и контрастностью; экспозиция и обработка должны быть одинаковы как для фотографий испытуемого образца, так и для определения увеличения.
На видимый размер фотографии влияют процессы экспонирования, проявления и печати, разрешающая способность микроскопа.
Характеристика формы частиц
На рис. 1 представлены наиболее часто встречающиеся формы частиц.
Рисунок 1 – Формы частиц
1 – равносторонние: частицы с одинаковой длиной, шириной и толщиной,
включая кубические и сферические частицы;
2 – игольчатые: тонкие, похожие на иглу частицы, или сходные с ней
по соотношению длины и толщины;
3 – колоннообразные: длинные, тонкие частицы с шириной и толщиной
больше, чем игольчатые;
4 – чешуйчатые: тонкие, плоские с одинаковой шириной и длиной;
5 – пластинчатые: плоские, одинаковые по длине и ширине,
но с большей толщиной, чем чешуйчатые;
6 – планкообразные: крупные, тонкие, пластинчатые частицы.
Частицы могут быть иной, неопределённой формы.
Характеристика размера частиц
Способ определения размера частицы зависит от её формы. Для сферических частиц размер определяется диаметром. Размер частиц, представленных на рис. 1, обычно определяют по значению максимальной длины. На рис. 2 представлены размеры, обычно используемые для характеристики частиц неправильной формы.
Рисунок 2 – Способы определения размеров частиц неправильной формы
1 – Диаметр Фере – расстояние между параллельными линиями, касательными к случайно ориентированной частице и перпендикулярными к шкале окуляра;
2 –Диаметр Мартина – длина хорды, которая делит площадь проекции случайно ориентированной частицы на две равные части;
3 – Эквивалентный диаметр – диаметр окружности, площадь которой равна
площади проекции частицы;
4 –Максимальный размер по горизонтали;
5 – Длина – максимальный размер частицы, ориентированной параллельно шкале окуляра, от одного её конца до другого;
6 – Ширина – максимальный размер частицы, измеренный под прямым углом к длине.
Под единичной частицей, как правило, подразумевают мельчайшее образование. Частица может быть жидкой или вязкой каплей, моно- или поликристаллической, аморфной или агломератом; частицы могут быть ассоциированными.
По степени ассоциации частицы могут быть описаны следующими терминами:
- ламеллары – скученные пластинки;
- агрегаты – масса слипшихся частиц;
- агломераты – сплавленные или сцементированные частицы;
- конгломераты – смесь двух или более типов частиц;
- сферолиты – сферический кластер тонких игольчатых кристаллов;
- друзы – частицы, покрытые очень мелкими частицами.
Поверхность частиц может быть описана следующим образом:
- гладкая – свободная от неровностей, шероховатости или налипаний;
- шероховатая – неровная, негладкая;
- ломкая – частично расщеплённая, разрушенная, с трещинами;
- пористая – имеющая отверстия или ходы;
- изрытая – с маленькими выемками.
Частицы могут быть описаны также:
- по форме краёв – угловатые, зазубренные, гладкие, острые, ломкие;
- по оптическим свойствам – окрашенные, прозрачные, полупрозрачные, непрозрачные;
- по наличию дефектов – без включений, с включениями.