-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 31.10.2018 № 749 |
Дата введения в действие: | c 01.12.2018 |
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания |
Раздел: | 1.8.2. Методы анализа лекарственных препаратов из крови и плазмы крови человека и животных |
Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
Номер: | ОФС.1.8.2.0008.15 |
Внутр.№: | 2469.1 |
Статус: | Действующая статья |
Определение содержания антиальфастафилолизина (специфических антител) в лекарственных препаратах из сыворотки крови человека и животных |
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения содержания антиальфастафилолизина (специфических антител), предназначенный для оценки специфической активности препаратов крови (донорская плазма, плазма для фракционирования, иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного и внутримышечного введения, иммуноглобулин человека антистафилококковый для внутримышечного введения), иммуногенности анатоксинов стафилококковых (раствора и суспензии) для подкожного введения, а также для определения активности токсина стафилококкового диагностического. С помощью описываемого метода определяют содержание антиальфастафилолизина - специфических антител к экзотоксину стафилококковому (син.: альфа-токсин, токсин стафилококковый, альфастафилолизин).
Метод основан на способности специфических антител нейтрализовать гемолитические свойства стафилококкового альфатоксина.
- 0,9% раствор натрия хлорида (рН );
- стандартный образец (СО) антиальфастафилолизина;
- набор реагентов для определения уровня антиальфастафилолизина в сывороточных препаратах крови человека и животных (токсин стафилококковый диагностический).
Стандартный образец (СО) антиальфастафилолизина представляет собой раствор очищенной концентрированной сыворотки крови лошади в глицерине, полученный путем иммунизации лошадей стафилококковым анатоксином, который содержит антитела к альфастафилолизину. Активность стандартного образца (СО) выражается в Международных единицах (МЕ).
Для того, чтобы исключить искажение результатов испытания специфической активности препаратов, обязательно определяют уровень содержания антиальфастафилолизина в сыворотке крови кроликов-доноров. Пригодными считаются те кролики, в сыворотке крови которых антиальфастафилолизин отсутствует или содержится в количестве не более 0,125 МЕ/мл. Кролик в качестве донора может быть использован в течение 3 - 6 мес.
Кровь берут из сердца или краевой вены уха кролика-донора в стерильный сосуд со стеклянными бусами и дефибринируют её, встряхивая флакон круговыми движениями в течение 10 - 15 мин. Кровь освобождают от сгустка фибрина и бус, в асептических условиях фильтруя ее в стерильный флакон через стерильную марлю, сложенную в три слоя. Дефибринированная кровь пригодна для приготовления взвеси эритроцитов в течение 2 дней при условии хранения её при температуре от 2 до 8°С.
Кровь кролика можно консервировать в равных объемах модифицированного раствора Олсвера.
Приготовление модифицированного раствора Олсвера. В 1200 мл воды очищенной растворяют 24,6 г глюкозы, 9,6 г натрия цитрата, 5,04 г натрия хлорида, доводят рН до 6,1 с помощью 1 М раствора лимонной кислоты и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Консервированная кровь пригодна для приготовления взвеси эритроцитов в течение 30 дней при условии хранения при температуре от 2 до 8°С.
В день проведения испытания эритроциты кролика из дефибринированной или консервированной крови отмывают трижды пятикратным объемом 0,9% раствора натрия хлорида и последующего центрифугирования в течение 15 мин при 1500 об/мин.
Из осадка отмытых эритроцитов готовят 15% суспензию, используя 0,9% раствор натрия хлорида. Для стандартизации методики устанавливают концентрацию эритроцитов в приготовленной взвеси, определяя оптическую плотность гемолизированного раствора эритроцитов. Для этого к 0,5 мл 15% взвеси эритроцитов кролика добавляют 2,0 мл воды очищенной, перемешивают круговыми движениями, после чего разводят полученный раствор 1:6.
После приготовления раствора гемолизированных эритроцитов измеряют оптическую плотность раствора гемоглобина, полученного в результате гемолиза, при длине волны 400 нм в кювете с толщиной слоя 1 мм. Контролем служит вода очищенная. Величина оптической плотности приготовленного раствора должна быть равна .
В случае, если этот показатель выше 0,54, к приготовленной 15% взвеси эритроцитов добавляют 0,9% раствор натрия хлорида в объеме , рассчитанном по формуле:
где: - начальный объем 15% взвеси эритроцитов;
- значение оптической плотности гемолизированного раствора.
В случае, если значение оптической плотности ниже 0,52, то добавляют отмытые эритроциты в объеме , рассчитанном по формуле:
где: - объем отмытых эритроцитов, использованных для приготовления 15% взвеси, мл;
- значение оптической плотности гемолизированного раствора.
После добавления 0,9% раствора натрия хлорида или отмытых эритроцитов следует вновь определить оптическую плотность приготовленного раствора. Приготовленная 15% взвесь эритроцитов с установленным значением оптической плотности пригодна для проведения анализа в течение дня.
Токсин стафилококковый диагностический представляет собой фильтрат бульонной культуры токсигенного штамма стафилококка 0-15 и выпускается с установленным значением Lh (лимит гемолитического действия токсина). Лимит гемолитического действия токсина (Lh) - это минимальное количество стафилококкового токсина, соответствующее 1 МЕ (Международной единице) СО антиальфастафилолизина, которое вызывает почти полный гемолиз (+++) взятых в опыт эритроцитов кролика.
В день проведения испытания специфической активности препаратов необходимо установить Lh токсина в условиях опыта, т.к. вследствие влияния различных факторов (нестабильность стафилококкового токсина в процессе хранения, возможные колебания чувствительности отдельных партий эритроцитов кролика и др.) результаты могут отклоняться в ту или иную сторону.
Разведения токсина готовят, исходя из величины Lh, указанной в паспорте препарата. Осторожно, не касаясь стенок, в 7 пробирок вносят испытуемый токсин: в среднюю - в объеме, равном величине Lh по паспорту, в остальные - в соответствующих объемах с интервалом в 0,01 мл в стороны убывания и возрастания от средней пробирки. Затем в каждую пробирку добавляют 0,9% раствор натрия хлорида до объема 1,0 мл.
СО антиальфастафилолизина разводят до содержания 1 МЕ антиальфастафилолизина в 1,0 мл и добавляют по 1,0 мл приготовленных разведений токсина в каждую пробирку с СО. В контрольную пробирку (контроль отсутствия спонтанного лизиса эритроцитов кролика) вносят 2,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки со смесью антигена (стафилотоксина) с антителом (СО антиальфастафилолизина) осторожно встряхивают и инкубируют при температуре от 18 до 22°С в течение 15 мин. Затем в каждую пробирку ряда (опытные и контрольную) добавляют по 0,1 мл свежеприготовленной 15% взвеси эритроцитов с установленной величиной оптической плотности. Пробирки снова осторожно встряхивают и инкубируют в термостате при температуре °С в течение 1 ч. Результаты учитывают визуально по степени гемолиза:
(++++) - полный гемолиз эритроцитов;
(+++) - почти полный гемолиз эритроцитов;
(++) - частичный гемолиз (50%-ный гемолиз эритроцитов);
(+) - следы гемолиза эритроцитов;
( - ) - отсутствие гемолиза эритроцитов. В контрольной пробирке гемолиз эритроцитов должен отсутствовать.
Количество токсина, содержащееся в первой пробирке, в которой произошел почти полный гемолиз (+++) эритроцитов, принимается за лимит его гемолитического действия в условиях опыта.
Стафилококковый токсин с установленной величиной Lh непосредственно перед проведением анализа разводят 0,9% раствором натрия хлорида до содержания Lh/5 в 1,0 мл (рабочий раствор токсина). Количество исходного токсина и объем рабочего раствора стафилококкового токсина, необходимый для проведения анализа, рассчитывают, исходя из установленной величины Lh токсина и количества пробирок, необходимых для проведения анализа.
Для определения концентрации антиальфастафилолизина в 1 мл испытуемого препарата готовят его разведения с учетом предполагаемого содержания антиальфастафилолизина (в МЕ/мл) по схеме (табл. 1).
Таблица 1 - Схема разведения исследуемых препаратов
Каждый опыт сопровождается контролем, необходимым для подтверждения соблюдения условий проведения испытания. Контроль предусматривает оценку точности взятой в опыт дозы стафилококкового токсина и, при необходимости, коррекцию результатов опыта с помощью СО антиальфастафилолизина.
СО антиальфастафилолизина разводят 0,9% раствором натрия хлорида до содержания 1 МЕ антиальфастафилолизина в 1 мл. Далее из этого разведения, содержащего 1 МЕ/мл, готовят следующие разведения по схеме (табл. 2).
Таблица 2 - Схема разведения СО антиальфастафилолизина
В чистые пробирки вносят по 0,5 мл необходимых для анализа разведений испытуемого препарата (опытный ряд) и по 0,5 мл приготовленных разведений СО антиальфастафилолизина (контрольный ряд), затем в каждую пробирку вносят по 0,5 мл приготовленного разведения стафилококкового токсина (рабочего раствора токсина). Пробирки осторожно встряхивают круговыми движениями и инкубируют при температуре от 18 до 22°С в течение 15 мин.
Затем в каждую пробирку опытного и контрольного рядов добавляют по 0,05 мл свежеприготовленной 15% взвеси эритроцитов кролика с установленной величиной оптической плотности. Пробирки вновь осторожно встряхивают круговыми движениями и инкубируют при температуре °С в течение 1 ч.
После инкубации проводят учет результатов реакции по степени выраженности гемолиза.
Учет результатов начинают с визуальной оценки степени гемолиза. Для этого в контрольном и опытном рядах отбирают последнюю пробирку, в которой отмечается начало гемолиза (+), все пробирки с 50% (частичным) гемолизом (++) и первую пробирку с почти полным гемолизом (+++). Для остановки гемолиза отобранные пробирки помещают в холодильник на 10 минут при температуре 2-8°С. После охлаждения пробирки центрифугируют в течение 5 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость из каждой пробирки быстро и осторожно отбирают в чистые сухие пробирки и определяют оптическую плотность при длине волны 400 нм, используя кюветы с толщиной слоя 1 мм. Раствором сравнения служит 0,9% раствор натрия хлорида. Оптическая плотность, соответствующая 50% гемолизу эритроцитов, должна быть равна .
Аналогичным образом определяют оптическую плотность
надосадочной жидкости в пробирках контрольного ряда, содержащих разведения СО
антиальфастафилолизина. При оптимальных условиях опыта 50% гемолиз эритроцитов
и величина оптической плотности, равная , регистрируются в
пробирке, содержащей 0,1 МЕ СО антиальфастафилолизина, т.е. расчетная доза
Lh/10 точно соответствует её истинному значению. В этом случае пробирка
опытного ряда, в которой зарегистрирован гемолиз 50% эритроцитов, содержит
0,1 МЕ антиальфастафилолизина в объеме 0,5 мл, что соответствует
содержанию 0,2 МЕ в мл. Для расчета содержания антиальфастафилолизина
в 1,0 мл неразведенного исследуемого образца, необходимо 0,2 МЕ
умножить на величину разведения в данной пробирке. Например, первая пробирка, в
которой надосадочная жидкость имеет величину оптической плотности
, содержит препарат в
разведении 1:100; следовательно, 1 мл неразведенного препарата содержит
0,2 МЕ-100=20 МЕ.
В результате влияния различных факторов возможно несоответствие дозы токсина, используемой в опыте, получаемому расчетному значению. В таких случаях при расчете специфической активности испытуемых препаратов применяется коэффициент пересчета (К), определяемый для каждого конкретного анализа по формуле:
где: a - концентрация (количество МЕ) СО антиальфастафилолизина в первой пробирке контрольного ряда, в которой зарегистрирован гемолиз 50% эритроцитов, дающий оптическую плотность надосадочной жидкости .
Для исключения искажения результатов при определении специфической активности иммуноглобулинов и препаратов крови, необходимо определять содержание антиальфастафилолизина в сыворотке крови кроликов, используемых в качестве доноров для получения эритроцитов, а также при подборе кроликов для проведения испытания иммуногенности (специфической активности), специфической безвредности и антигенной активности стафилококковых анатоксинов. Для таких целей пригодны кролики, в сыворотке крови которых антиальфастафилолизин отсутствует или содержится в количестве не более 0,125 МЕ/мл.
Для определения малых концентраций антиальфастафилолизина можно использовать метод титрования препарата с использованием более высоких разведений токсина (Lh/20, Lh/40, Lh/80, и т.д.).
Определение содержания антиальфастафилолизина в сыворотках крови кроликов проводят следующим образом: испытуемые сыворотки разводят в 5 раз 0,9% раствором натрия хлорида. Для этого в пробирку с 4,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида добавляют 1,0 мл сыворотки. Затем в необходимых количествах готовят разведения стафилококкового токсина с содержанием в 0,5 мл Lh/40 и Lh/80. Для приготовления разведений токсина используют токсин с точно установленной в день испытания величиной Lh.
Разведенную в 5 раз сыворотку разливают по 0,5 мл в 3 пробирки, затем в первую и вторую добавляют по 0,5 мл токсина в разведениях Lh/40 и Lh/80 соответственно, а в третью, являющуюся контрольной, вносят 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Для контроля наличия литического действия токсина берут еще 2 пустые пробирки и наливают в них по 0,5 мл каждого приготовленного разведения токсина и по 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Пробирки осторожно встряхивают, оставляют при температуре 18 - 22°С в течение 15 мин, а затем во все пробирки добавляют 0,05 мл свежеприготовленной в день испытания 15% взвеси эритроцитов кролика-донора. Пробирки вновь осторожно встряхивают и инкубируют при температуре °C в течение 1 ч. Результаты учитывают визуально по степени гемолиза эритроцитов (табл.3). В контрольной пробирке N 3 (без добавления токсина) гемолиз эритроцитов должен отсутствовать; в контрольных пробирках с соответствующими разведениями токсина должен произойти полный гемолиз эритроцитов.
Таблица 3 - Примеры оценки результатов опыта
Результаты следует считать относительно точными, поскольку опыт не сопровождается контролем с СО антиальфастафилолизина. Необходимость включения в опыт контрольного ряда СО в данном случае не оправдана, принимая во внимание цели испытания и концентрацию антиальфастафилолизина. При необходимости точного определения малых концентраций антиальфастафилолизина следует использовать методику, описанную выше, но использовать более высокие разведения токсина.