-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
| Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 31.10.2018 № 749 |
| Дата введения в действие: | c 01.12.2018 |
| Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания |
| Раздел: | 1.7.2. Методы анализа биологических лекарственных препаратов |
| Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
| Номер: | ОФС.1.7.2.0035.18 |
| Внутр.№: | 2450.1 |
| Статус: | Действующая статья |
Пептидное картирование (или составление пептидных карт) является методом идентификации белков, в особенности получаемых методом рекомбинантных ДНК.
Метод включает в себя этапы химического или энзиматического расщепления белков до образования пептидных фрагментов с последующим разделением и идентификацией этих фрагментов в воспроизводимых условиях.
Это надежный метод испытания, характеризующийся достаточной специфичностью и позволяющий произвести идентификацию замены практически каждой отдельной аминокислоты, произошедшего в результате таких явлений, как ошибка в считывании последовательности комплементарной ДНК (кДНК), либо являющегося результатом мутации.
Составление пептидных карт является сравнительным испытанием, поскольку получаемая информация сравнивается со стандартным образцом, подвергающимся аналогичному воздействию. Данное испытание позволяет подтвердить первичную структуру белка, определить возможные изменения первичной структуры в случае наличия таковых, подтвердить соответствие технологического процесса и генетическую стабильность.
Статья содержит описание аспектов использования и валидации метода пептидного картирования с целью получения характеристики анализируемого белка, оценки стабильности клеточных систем экспрессии, используемых для получения продуктов рекомбинантных ДНК и оценки согласованности процесса в целом - в отношении как оценки стабильности продукта, так и обеспечения идентичности белка, либо определения содержания протеинов с изменениями в структуре.
Составление пептидных карт может рассматриваться как метод получения "отпечатков пальцев" белка и представляет собой получаемую в результате ряда химических процессов полную расшифровку анализируемого белка. Метод включает четыре принципиальные стадии: выделение и очистка белка (или "подготовка белка к гидролизу") - в случае, если белок входит в состав какой-либо смеси; избирательное расщепление пептидных связей (гидролиз); хроматографическое разделение образующихся пептидных фрагментов; анализ и идентификация пептидов.
Анализируемый образец подвергается расщеплению и анализу параллельно со стандартным образцом. Полное расщепление пептидных связей более вероятно при использовании ферментов, таких как эндопептидазы (например, трипсин), а не химических гидролизующих реагентов. Для того, чтобы карта была информативной, она должна содержать достаточное количество пептидов. С другой стороны, в случае, если пептидных фрагментов будет слишком много, карта может утратить свою специфичность, поскольку у многих белков может оказаться аналогичный профиль.
Пептидное картирование не является общим методом, а заключается в составлении индивидуальных карт для каждого отдельного белка.
Методики испытания должны быть приведены в фармакопейной статье или нормативной документации на субстанции или лекарственную форму.
Подготовка белка к гидролизу включает этапы подготовки белка к расщеплению (восстановление, денатурацию, алкилирование и пр.) выделение и очистку белка от вспомогательных соединений.
Подготовка белка к гидролизу, в т.ч. этап выделения и очистки являются обязательными при проведении испытания нерасфасованных или дозированных форм лекарственных средств, содержащих белки, в тех случаях, когда они содержат мешающие испытанию вспомогательные вещества или белковые носители.
Количественное извлечение белка из дозированной формы должно быть валидировано.
В зависимости от размера, конфигурации белка, а также состава лекарственного средства и готовой лекарственной формы, используются различные подходы в подготовке белка к гидролизу.
В некоторых случаях может быть необходимо концентрирование образца либо отделение белка от используемых в готовой лекарственной форме сопутствующих веществ и стабилизаторов, которые могут искажать результаты картирования.
Для обеспечения полного доступа фермента к местам разрыва связей во многих случаях необходимо сократить число дисульфидных связей путем их восстановления и алкилирования, а так же использовать частичную денатурацию белка добавлением соответствующих агентов. В качестве восстанавливающих агентов возможно использование, например, дитиотрейтола или меркаптоэтанола, для алкилирования йодацетамида, 4-винилпиридина, йодуксусной кислоты, для денатурирования мочевины, и гуанидина.
Физические методы выделения и очистки белка с использованием колоночной хроматографии, диализа, ультрафильтрации, лиофилизации могут использоваться в ходе подготовки белка к гидролизу наряду с восстановлением, алкилированием и денатурацией или как самостоятельные процедуры.
Очистка белка от низкомолекулярных компонентов, входящих в состав лекарственного средства или лекарственного препарата может проводиться различными методами. Наиболее часто используются следующие способы, отличающиеся техническим исполнением позволяющих отсекать вещества с различной молекулярной массой: гельфильтрация (обессоливание), например с использованием таких сорбентов как сефадекс, диффузия низкомолекулярных соединений через полупроницаемую мембрану (диализ) и ультрафильтрация с использованием фильтров, снабжённых мембранами с различным размером пор из восстановленной целлюлозы, полиэфирсульфона, ацетата целлюлозы, нейлона.
Наиболее типичными реагентами, входящими в состав буферных растворов, используемых в ходе пробоподготовки являются ACES-буферный раствор, три(гидроксиметил)-аминометан, гидроксиламин, этилдиаминотетрауксусная кислота и др.
Подготовка белка с использованием перечисленных методов проводится до этапа расщепления пептидных связей и пептидного картирования.
Подробное описание процедур выделения и очистки белка приводится в нормативной документации.
Выбор метода расщепления пептидных связей зависит от анализируемого белка. Процедура выбора включает определение требующегося типа расщепления (химического или ферментативного), а также типа протеолитического реагента в рамках выбранной категории. В таблице 1 приводится ряд протеолитических реагентов и их специфичность в отношении пептидных связей. Помимо указанных, могут быть использованы другие реагенты, способные расщеплять пептидные связи.
Таблица 1. Примеры реагентов для расщепления пептидных связей
|
гидрофильные остатки (например, лейцин, метионин, аланин, ароматические аминокислоты) |
||
Расщепление пептидных связей с использованием трипсина может привести к отклонениям от пептидной карты, полученной в ходе валидации методики, в следствие протекающих параллельно с протеолитическим расщеплением побочных реакций, таких как неспецифическое расщепление, дезаминирование, дисульфидная изомеризация, окисление остатков метионина, образование пироглутаминовых групп при дезаминировании глутамина и N-концевых участков пептида.
Изменения в пептидной карте в виде дополнительных пиков могут также появляться в следствие автогидролиза трипсина. Интенсивность их образования зависит от соотношения содержания трипсина к белку в реакционной смеси. Для предотвращения автогидролиза растворы протеаз готовят при рН, отличном от оптимального (например, при рН 5 для трипсина), благодаря чему фермент не переходит в активное состояние до момента разведения с буферным раствором.
В некоторых случаях, при использовании трипсина для расщепления пептидных связей белка с молекулярной массой более 100 000 Да, может потребоваться защита лизиновых остатков путем получения производных с лимонной или малеиновой кислотой, так как в противном случае может образоваться слишком большое число пептидных фрагментов.
Требования к реагентам для расщепления пептидных связей.
Под реагентами в процедурах пептидного картирования подразумеваются химические агенты и ферменты, используемые для расщепления пептидных связей.
Требования к квалификации и качеству реагентов должны быть указаны в нормативной документации.
Использование реагентов, особенно ферментов, квалификации и качества отличных от установленной в ходе валидации методики, например другого производителя, нежели указано в нормативной документации, может привести к невоспроизводимости хроматографических профилей.
В случаях, когда требуется какая-либо специальная подготовка реагента, например, для обеспечения определённой чистоты фермента или химического агента, эти процедуры должны быть описаны в нормативной документации
Установление оптимальных условий для расщепления пептидных связей.
Факторы, которые влияют на полноту и эффективность расщепления протеинов, являются факторами, оказывающими влияние на химические и ферментативные реакции.
рН реакционной среды. Значение рН смеси, в которой осуществляется расщепление пептида, определяется эмпирически и направлено на оптимизацию состояния расщепляющего реагента. Например, при использовании при использовании трипсина в качестве расщепляющего агента оптимальной является слабощелочная среда (рН 8), применение цианобромида в качестве расщепляющего реагента требует создания сильнокислой среды (например, рН 2, за счёт использования муравьиной кислоты). Главным является требование, чтобы значение рН реакционной среды не изменяло структуру белка в ходе реакции расщепления и не изменялось в ходе проведения гидролиза.
Температура. Для большинства реакций расщепления наиболее подходящей является температура в интервале от 25°С до 37°С.
Создаваемая температура должна способствовать минимизации побочных химических реакций. Тип протеина, подвергаемого расщеплению, определяет выбор температуры реакционной среды, поскольку некоторые белки с повышением температуры склонны к денатурации. Например, расщепление рекомбинантного бычьего соматропина проводится при температуре 4°С, поскольку при более высокой температуре он осаждается в ходе проведения реакции расщепления.
Время. Время проведения гидролиза оказывает существенное влияние на получаемую пептидную карту, поэтому следует установить оптимальное время для получения воспроизводимой карты, с одной стороны, и достаточное для проведения полного расщепления, с другой. Время расщепления варьируется от 2 ч до 30 ч.
Реакция гидролиза прекращается либо прибавлением кислоты или других веществ, которые не оказывают влияния на получаемую пептидную карту либо замораживанием. Наиболее часто используются растворы трифторуксусной кислоты, меркаптоэтанол.
Количество используемого расщепляющего реагента. Для обеспечения достаточного быстрого расщепления (от 6 ч до 20 ч) используется избыточное количество расщепляющего реагента, вместе с тем, его количество должно быть минимизировано, чтобы предотвратить вклад реагента в структуру пептидной карты.
В большинстве случаев протеин, подвергаемый гидролизу, и реагент берут в соотношении от 10:1 до 500:1.
Для оптимизации процедуры расщепления может потребоваться добавление расщепляющего агента в два или более этапов.
При этом степень разведения реагирующей смеси должна оставаться достаточно небольшой для обеспечения следующего этапа пептидного картирования - разделения. Для того, чтобы исключить наличие артефактов, т.е. пиков не относящиеся к белку и их влияние на результаты пептидного картирования, при процедуре расщепления пептидных связей необходимо предусмотреть проведение контрольного определения со всеми реагентами, за исключением анализируемого белка.
Для разделения пептидных фрагментов используются различные методы. Выбор метода зависит от белка, для которого составляется пептидная карта.
Методы, наиболее часто используемые для разделения пептидных фрагментов:
1) Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография;
2) Ионообменная хроматография;
3) Хроматография гидрофобного взаимодействия;
Наиболее часто используемым методом является метод обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Хроматографическая колонка. Для каждого белка выбор колонки осуществляется эмпирически.
Наиболее часто хроматографическое разделение пептидных фрагментов, полученных в результате гидролиза осуществляется на колонках, заполненных сорбентами на основе гидрофобных силикагелей с привитыми группами С18, С8, С4 или иными сорбентами, с размером частиц от 3 нм до 10 мкм или 1,7-2,5 мкм (при использовании ультраэффективной жидкостной хроматографии) и размером пор от 130 до 300 А.
Подвижная фаза. Подвижную фазу выбирают исходя из свойств испытуемого образца, типа сорбента колонки и метода детектирования. Наиболее часто в качестве подвижной фазы используются вода и ацетонитрил в качестве органического модификатора с добавлением 0,1% кислоты трифторуксусной. При необходимости, для повышения растворимости компонентов смеси, могут прибавлятся 1-пропанол, 2-пропанол или другие модификаторы. Прибавление спиртов не должно приводить к чрезмерному повышению вязкости компонентов.
Подвижная фаза, содержащая фосфатный буфер, может быть использована в случаях, когда необходимо увеличить разделяющую способность системы, поскольку изменение рН в интервале от 3,0 до 5,0 улучшает разделение пептидов, содержащих кислотные остатки (например, глутаминовая и аспарагиновая кислоты). Натрия или калия фосфаты, ацетат аммония, фосфорная кислота при значении рН между 2 и 7 (или выше при использовании полимерного наполнителя) используются с ацетонитрильным градиентом.
В качестве растворителей используются различные буферные растворы.
В большинстве случаев применяется градиентное элюирование, поскольку позволяет достичь эффективного и быстрого разделения пептидных фрагментов, представляющих собой сложные смеси различного состава обладающих различными свойствами
При элюировании рекомендуется низкая скорость изменения состава. Градиент оптимизируют, добиваясь четкого разделения между всеми реперными пиками, выбранными в качестве "маркерных" пиков для проводимого испытания.
Наиболее распространенным детектором при пептидном картировании является спектрофотометрический детектор, с определением поглощения при аналитической длине волны в интервале от 200 нм до 280 нм (обычно 214 (215) нм, могут использоваться также длины волн 210, 256 нм). Для повышения информативности, используются также флуориметрический и масс-спектрометрический детекторы.
Для достижения хорошей воспроизводимости, как правило, требуется контроль температуры колонки, которая варьируется в широких пределах от 25 до 60°С. Скорость подвижной фазы составляет от 0,1 мл/мин до 2,0 мл/мин.
Целью валидированного метода характеристики протеина методом пептидного картирования является определение как минимум 95% теоретического состава структуры белка.
Использование стандартного образца параллельно с испытуемым пептидом является необходимым условием при разработке и валидации методик пептидного картирования.
В ходе разработки методики пептидного картирования осуществляется подбор условий подготовки белка к гидролизу и описываются последовательности аминокислот для каждого пептидного фрагмента, получаемого в результате гидролиза.
Установление первичной структуры пептидных фрагментов (последовательности аминокислот), образованных в ходе гидролиза необходимо, поскольку пептидное картирование обеспечивает как подтверждение известной первичной структуры, так и идентификацию структуры отличающихся по составу белков (в случае их наличия) при сравнении с пептидной картой стандартного образца пептида, структура которого установлена.
Разработка и валидация метода составления пептидных карт при разработке нормативной документации на лекарственное средство требует исчерпывающей характеристики каждого из индивидуальных пиков пептидной карты. Для характеристики индивидуальных пиков могут быть использованы как метод N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот, так и метод с использованием масс-спектроскопии.
В случаях, когда для установления первичной последовательности аминокислот используется метод N-концевого секвенирования с последующим анализом аминокислот, аналитическое разделение масштабируют для целей препаративного разделения. Необходимо убедиться на основании эмпирических данных, что ухудшения разрешения между пиками вследствие проведения масштабирования не происходит. Элюаты, соответствующие пикам определённых пептидных фрагментов, собирают, концентрируют и повторно хроматографируют, при необходимости. Аминокислотный анализ фрагментов может быть ограничен размером пептидов. В случае если N-концевая аминокислота заблокирована, может потребоваться ее высвобождение до секвенирования. С целью получения характеристики может также использоваться С-концевое секвенирование белков в комбинации с карбоксипептидазой и методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролетным масс-анализатором (MALDI-TOF).
Использование масс-спектроскопии для характеристики пептидных фрагментов производится либо путем непосредственного введения выделенных пептидов, либо с использованием on-line системы ВЭЖХ с масс-спектрометром для анализа разделяемых фрагментов.
Тандемная масс-спектроскопия также используется для определения последовательности модифицированных белков и для определения типа произошедшей аминокислотной модификации.
Идентификация полученных фрагментов может быть осуществлена с помощью современных компьютерных баз данных.
Определение расположения дисульфидных связей в различных сульфгидрил-содержащих пептидах может быть произведено методом сравнения масс-спектров продукта расщепления до и после восстановления.
Если некоторые части первичной структуры не могут быть достаточно четко отражены пептидной картой, может потребоваться составление вторичной пептидной карты. Получение вторичной пептидной карты заключается в выделении полученных при гидролизе пептидных фрагментов с последующим их вторым расщеплением в выбранных условиях, хроматографическим разделением, обнаружением и идентификацией. Выделение пептидных фрагментов после первого гидролиза проводится, как правило, методами колоночной хроматографии. Условия гидролиза, разделения и идентификации при получении вторичной пептидной карты отличаются от условий получения первичной пептидной карты.
Для каждого из белков характерна совокупность уникальных свойств, обусловленных его первичной структурой и структурами более высокого порядка. Пики пептидных фрагментов наиболее характерных для данного пептида и/или отражающих наиболее важные свойства испытуемого пептида, например, комплимент зависимую область, выбираются в качестве характерных (реперных) пиков. Выбор реперных пиков должен быть обоснован, а перечень реперных пиков приводится в нормативной документации.
Методики пептидного картирования подлежат валидации. Характеристики, подлежащие валидации определяются критическими параметрами испытания, влияющими на интерпретацию результатов и их приемлемость. К критическим параметрам методик пептидного картирования относятся специфичность, прецизионность, устойчивость, а также полнота проведённого гидролиза.
Использование стандартного образца параллельно с испытуемым белком является необходимым при установлении значений критериев валидации методики и разработке на их основе критериев оценки пригодности системы.
Для контроля полноты требуемого расщепления пептидных связей (степени гидролиза) используется сравнение со стандартным образцом, который подвергается такому же воздействию, как и испытуемый пептид.
Степень гидролиза может подтверждаться сопоставлением теоретической и фактической пептидных карт, оценкой степени инверсии белка, воспроизводимостью пептидной карты в части количества и интенсивности (относительной интенсивности) пиков и другими способами.
Сопоставление теоретической и фактически полученных пептидных карт осуществляется в ходе разработки и валидации методики. Теоретическая и фактически полученная пептидные карты должны соответствовать друг другу. Теоретическая пептидная карта составляется на основании первичной структуры пептида и специфичности используемого реагента в части сайтов расщепления.
Полного соответствия фактической пептидной карты теоретической возможно достичь не всегда.
На фактической пептидной карте, например, возможно присутствие сдвоенных пиков пептидных фрагментов, т.е. пиков, получаемых элюированием двух пептидных фрагментов. Наличие отдельных сдвоенных (неразделенных) пиков на пептидной карте допускается, если это не снижает надёжности подтверждения первичной структуры пептида. Сдвоенные пики не должны включать пептидные фрагменты с участками пептида, обеспечивающими фармакологическое действие или активность лекарственного средства, т.е. критичные для свойств анализируемого пептида.
Наличие сдвоенных пиков должно быть подтверждено и обосновано при разработке и валидации методики испытания и указано в нормативной документации на лекарственное средство.
На фактической пептидной карте возможно отсутствие отдельных пиков коротких пептидных фрагментов, обладающих низкой интенсивностью. Отсутствие отдельных пиков коротких пептидных фрагментов, обладающих низкой интенсивностью на пептидной карте, допускается, если это не снижает надёжности подтверждения первичной структуры пептида. На пептидной карте не должны отсутствовать пики, пептидных фрагментов, содержащих участки пептида, обеспечивающих фармакологическое действие или активность лекарственного средства, т.е. критичные для свойств анализируемого пептида. Возможность отсутствия отдельных пиков должна быть подтверждена и обоснована при разработке и валидации методики испытания и указана в нормативной документации на лекарственное средство.
Степень инверсии белка оценивается наличием интактного белка и его количеством, выражаемым интенсивностью пика интактного белка.
Критические параметры оценки пригодности системы для пептидного картирования будут зависеть от конкретного используемого метода разделения и детектирования, а также требований к получаемым в результате испытания данным.
При валидации специфичности методики проводится сопоставление теоретической и фактической пептидных карт изучаемого пептида, а также подтверждение наличия выраженных отличий в пептидных картах изучаемого пептида и пептидов, отличающихся от него по составу путём сопоставления пептидных карт каждого из анализируемых пептидов.
Для подтверждения наличия выраженных отличий в пептидных картах может быть использована охарактеризованная по составу смесь, включающая стандартный образец изучаемого пептида и пептид, отличный от него по структуре. Использование охарактеризованных по составу смесей наиболее показательны в случае, если пики (реперные пики) отличных по составу пептидов элюируются в области худшего разделения пиков на пептидной карте.
В качестве пептида, отличного по структуре от испытуемого образца может быть использован пептид принципиально иной структуры, например, производимый на одной производственной площадке и сходный по молекулярной массе с испытуемым пептидом или вариант испытуемого пептида, отличный от него в определённых участках первичной последовательности (вариабельный пептид) или пептид близкой структуры, но имеющий выраженные отличия в небелковой части молекулы (например, пегилированный и непегилированный варианты пептида).
Специфичность методики также дополнительно оценивается статистической обработкой соотношений анализируемых параметров пиков и хроматографического профиля смеси 1:1 (об/об) продуктов гидролиза испытуемого образца и стандартного образца.
Специфичность методики и идентичность анализируемого образца пептида подтверждается, если все пики продуктов гидролиза изучаемого пептида и его стандартного образца имеют аналогичные времена удерживания и соотношения оцениваемых параметров пиков. Если пики, которые изначально характеризовались значительно различающимися временами удерживания, затем в смеси 1:1 обнаруживались единым пиком, изначально выявленное различие является показателем нестабильности выбранной системы разделения пептидов. Однако если в смеси 1:1 наблюдаются разделенные пики, это является доказательством наличия различных пептидов в каждом из пиков. Если пик в смеси 1:1 существенно шире, чем соответствующий пик в анализируемом белке и стандартном образце, это может означать наличие различных пептидов.
При определении структуры пептида методом пептидного картирования важнейшим критерием пригодности системы является её разделительная способность.
В зависимости от изучаемого пептида и используемого метода разделения могут устанавливаться требования к разрешению между пиками двух или более пептидных фрагментов. Наиболее критичным параметром будет разрешение между пиками пептидных фрагментов, выбранных в качестве реперных или между пиками, один из которых является реперным.
Прецизионность является одной из основных характеристик, оцениваемых в ходе валидации методики пептидного картирования.
Валидируется воспроизводимость таких характеристик пептидной карты, как количество реперных пиков, интенсивность или относительная интенсивность реперных пиков (высота или площадь), разрешение между пиками.
Требования к специфичности, разделительной способности и прецизионности должны быть включены в оценку пригодности системы в нормативной документации на лекарственное средство.
При оценке специфичности, разделительной способности и прецизионности методики требуется получение фактических пептидных карт как стандартного, так и испытуемого образцов изучаемого пептида.
Валидации могут подлежать другие характеристики методики, рассматриваемые в качестве её критичных параметров, например, визуальный контроль растворимости пептида, чувствительность системы, т.е. измерение откликов трудно расщепляемых пептидов, степень присутствия интактного пептида, оценка мешающего влияния плацебо, возможность автогидролиза трипсина.
Например, валидация и включение в методику нормативной документации оценки чувствительности системы необходимы в том случае, если пики, содержащие пептидные фрагменты критичные для свойств анализируемого пептида, обладают низкой интенсивностью.
Представляемые данные по валидации методики должны включать типичные хроматограммы стандартного и испытуемого образцов.
Обнаружение и идентификация пиков пептидных фрагментов выполняются при помощи внутренних и внешних стандартов. В качестве внешних стандартов используется стандартный образец идентифицируемого пептида. В качестве внутреннего стандарта используется один из пиков пептидной карты, демонстрирующий наименьшую вариабельность в качестве в части своего времени удерживания и интенсивности (высоты или площади).
Способ обнаружения и идентификации пиков пептидных фрагментов приводится в нормативной документации на лекарственное средство.
Небольшие отличия в числе обнаруженных пиков пептидных фрагментов, степени их разрешения, интенсивности, а также других характеристиках прецизионности, по сравнению с валидированными значениями, является ожидаемым явлением при воспроизведении методик пептидного картирования. Поэтому особенно важно включение чётких критериев соответствия, а также пределов допустимого отклонения для указанных параметров пригодности системы, в нормативную документацию на лекарственное средство.
Идентификация пептидов включает в себя визуальную оценку полученных пептидных карт испытуемого и стандартных образцов, а также количественную оценку.
Оценке могут подлежать как полная пептидная карта, так и выбранные характерные участки хроматограмм испытуемого и стандартного образцов. Выбор участков должен быть обоснован в ходе валидации.
Визуальной оценке, в сравнении со стандартным образцом, подлежат: общая картина элюирования, выражаемая общим числом пиков, их относительной интенсивностью, наличием реперных пиков.
Количественной оценке подлежат: времена удерживания или относительные времена удерживания пиков (обычно реперных), параметры интенсивности пиков (площадь или высота) или их относительные значения. Количественная оценка может проводиться как по сравнению с внешним, так и по сравнению с внутренним стандартом.
Использование внутреннего стандарта при оценке интенсивности пиков позволяет исключить влияние возможного не полного гидролиза пептида, воспроизводимости этапов пробоподготовки (выделения и очистки белка). Выбор внутреннего стандарта должен быть обоснован в ходе валидации.
Как альтернативный вариант для испытуемого образца может быть рассчитан процент площади или высоты пика каждого пептидного фрагмента относительно суммы площади или высоты всех пиков или относительно одного пика, выбранного в качестве реперного. Затем полученный процент сравнивается со значением аналогичного параметра соответствующего пика стандартного образца.
Возможность автогидролиза трипсина контролируется при помощи создания пептидной карты плацебо, получаемой при обработке трипсином раствора без определяемого пептида.
Идентификация пептида и соблюдение специфичности методики, кроме сравнения с пептидной картой стандартного образца, подтверждаются и дополняются анализом хроматографического профиля и параметров пиков смеси 1:1 (об/об) продуктов гидролиза испытуемого образца и стандартного образца.
Можно произвести множественное сравнение времен удерживания и площадей или высоты пиков для выбранной группы соответствующих пиков, которые однозначно идентифицируются на пептидной карте.
Учитывая возможную вариабельность пептидных карт нормативный документ дополняют рисунками типичных пептидных карт стандартного и испытуемого образцов с указанием пиков (групп пиков) характерных пептидных фрагментов (реперных пиков).
Возможность присутствия на пептидной карте испытуемого образца пиков, не сопоставимых с пептидной картой стандартного образца (кроме областей выхода реперных пиков), их количество, время выхода и интенсивность (относительная интенсивность) должна быть указана в нормативной документации на лекарственное средство и обоснована.
Проведение как минимум двух параллельных испытаний продуктов гидролиза стандартного образца снижает вероятности проявления вариабельности пептидных карт при воспроизведении методик и позволяет подтвердить критерии прецизионности, и более точно оценить прочие количественные характеристики системы, если они включены в оценку пригодности системы.
Количество параллельных испытаний анализируемого и стандартного образцов указываются в нормативной документации на лекарственное средство.
Пригодность системы разделения пептидных фрагментов является минимальным требованием для оценки качества пептидного картирования, которая включает в качестве контроля в нормативную документацию на лекарственное средство.
Нормы к каждому из критериев пригодности системы разделении рассмотренных ниже, а также иные критерии, специфичные для каждого идентифицируемого пептида, необходимые для подтверждения соблюдения валидированного уровня специфичности, воспроизводимости и чувствительности системы должны быть установлены в ходе валидации.
В оценку пригодности в нормативной документации на лекарственное средство включают:
соответствие фактически полученной пептидной карты гидролизата стандартного образца пептидной карте, прилагаемой к указанному стандартному образцу в части общей картины элюирования, выражаемая общим числом пиков, их относительной интенсивностью, наличием всех характерных (реперных) пиков;
соответствие фактической разделительной способности системы установленным валидированным требованиям. Оценка разделительной способности проводится путём оценки разрешения или соотношения пик/долина между пиками наиболее важных пептидных фрагментов;
прецизионность времени удерживания или относительного времени удерживания пиков пептидных фрагментов или реперных пиков;
прецизионность интенсивности или относительной интенсивности реперных пиков (высоты или площади). Прецизионность оценивается величиной относительного стандартного отклонения;
отсутствие на пептидной карте плацебо пиков в интервале времени выхода пиков пептидных фрагментов идентифицируемого пептида.
Наряду с перечисленными критериями, могут оцениваться и другие параметры, (например, ширина пиков у основания, асимметрия) в случае, если контроль этих параметров необходим для подтверждения специфичности и прецизионности получаемых результатов.