Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод электрофореза ДНК в агарозном геле, предназначенный для определения размеров фрагментов ДНК, а также для их разделения по размеру.

Метод электрофореза ДНК в агарозном геле представляет собой разновидность зонального электрофореза, описанного в ОФС "Электрофорез".

Сущность метода заключается в том, что молекулы/фрагменты ДНК, заряженные отрицательно, под действием силы электрического поля движутся от отрицательного электрода - катода ("-") к положительному электроду - аноду ("+"). Агарозный гель, являясь вязкой средой, препятствует продвижению молекул/фрагментов - образцов ДНК, в связи с этим, короткие фрагменты ДНК движутся к аноду быстрее, чем длинные. Отношение величины заряда нуклеиновых кислот, мало зависящей от рН окружающей среды, к их массе практически одинаково, поэтому метод электрофореза в агарозном геле позволяет оценить только размеры различных фрагментов ДНК.

После проведения электрофореза проводят визуализацию разделенных фрагментов и анализ полученных результатов. Возможно также извлечение фрагментов ДНК из геля для проведения дальнейших исследований.

Методика электрофореза в агарозном геле

Подготовка к проведению анализа

На ровную поверхность устанавливают форму для заливки геля. Не касаясь дна формы (1-2 мм) помещают гребенки на расстоянии 5 см друг от друга или как указано в нормативной документации.

Приготовление буферных растворов

Для приготовления буферных растворов обычно используют готовые составы, входящие в комплекты реагентов для метода электрофореза в агарозном геле.

Для приготовления буферных растворов для электрофореза в агарозном геле, как правило, используют трис-боратный (ЭДТА, TBE) или трис-ацетатный (TAE) буферный раствор в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза и приготовления геля. Возможно использование других подходящих буферных растворов, которые указывают в нормативной документации. Буферный раствор для электрофореза, как правило, хранят при температуре 18 - 25°С в течение 1 нед или при температуре 2 - 8°С в течение 1 мес.

В буферный раствор для образцов добавляют специально подобранный краситель, а также глицерин или сахарозу, которые указывают в нормативной документации. Присутствие глицерина или сахарозы облегчает внесение образцов в лунки, а краситель позволяет в режиме реального времени наблюдать продвижение фронта образцов в геле. В качестве красителей используют: бромфеноловый синий, ксиленцианол, крезоловый красный или Orange G. Для каждой концентрации агарозного геля подбирают оптимальный краситель и его концентрацию.

Приготовление геля

Для приготовления агарозного геля в СВЧ-печи или на водяной бане расплавляют до прозрачного состояния необходимое количество смеси агарозы, буферного раствора, не допуская закипания геля. Расплавленную смесь охлаждают до температуры 50 - 60°С. Далее с помощью автоматического дозатора добавляют бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, тщательно перемешивают и смесь тонким слоем (до 5 мм) заливают на пластинку так, чтобы зубцы гребенок были погружены не менее, чем на 3 мм, не допуская образования пузырьков воздуха. Агарозный гель застывает в течение 30 - 60 мин при температуре 18 - 25°С.

Проведение электрофореза

Камеру для электрофореза заполняют буфером раствором с бромистым этидием, помещают туда пластинку с агарозным гелем и осторожно извлекают гребенку плавным движением вверх, избегая повреждения образовавшихся лунок.

Буферный раствор должен полностью покрыть пластинку с гелем слоем не менее 3-5 мм. Перед внесением в гель подготовленные пробы смешивают с буферным раствором для внесения в таком соотношении, чтобы в конечной пробе была рабочая (1х) концентрация буферного раствора. Полученные растворы вносят в лунки агарозного геля под буферный раствор для электрофореза, камеру для электрофореза закрывают, электроды подсоединяют к источнику тока и включают прибор. Молекулы/фрагменты ДНК одинакового размера (и одинакового заряда) движутся единым фронтом, образуя в геле дискретные зоны. Чем меньше размер молекул, тем быстрее они движутся от катода ("-") к аноду ("+"). Постепенно исходный образец ДНК, состоящий из разных макромолекул/фрагментов, разделяется на зоны, распределенные по длине пластинки. Процесс электрофореза отслеживают по фронту красителя в геле (заряженного низкомолекулярного вещества, которое входит в состав буферного раствора для внесения). Электрофорез останавливают при приближении красителя к концу пластинки. Необходимо учитывать размер фрагмента ДНК, концентрацию агарозного геля и природу лидирующего красителя, чтобы избежать выхода образца из геля раньше красителя (табл. 1).

Таблица 1 - Размеры фрагментов ДНК, имеющих скорость миграции некоторых популярных лидирующих красителей в зависимости от концентрации агарозы

[п.о.] - пар оснований

Оценка результатов

Результаты электрофореза ДНК в агарозном геле регистрируют в присутствии бромистого этидия - интеркалирующего соединения, образующего с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-светом с помощью трансиллюминатора. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос.

Если образец представляет собой дискретный набор макромолекул разного размера, то после проведения электрофореза образуются четкие полосы, расположенные на пластинке одна под другой в соответствии с их размером. Для определения относительной молекулярной массы фрагментов ДНК одновременно с исследуемым образцом проводят электрофорез маркеров макромолекул ДНК с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец, содержащий маркеры ДНК, вносят в отдельную лунку. Для определения молекулярной массы образца сравнивают его положение в геле относительно положения маркеров. Для удобства возможно построение калибровочного графика зависимости логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Rf (величины, равной отношению расстояний, пройденных маркером и красителем).

Разделение линейных молекул

Для разделения линейных двухцепочечных молекул ДНК используют гели с различной концентрацией агарозы от 0,3% до 2%, соответствующие определенному размеру молекул ДНК (табл. 2).

Таблица 2. Соотношение гелей с различной концентрацией агарозы и размеров разделяемых фрагментов ДНК

[kbp] - 1000 пар оснований ДНК

Нижний предел размеров ДНК определяется в основном диффузией полосы в геле. В гелях с низкой концентрацией агарозы фрагменты ДНК небольших размеров разделяются, но четкость разделения полос невысокая.

Верхний предел размеров ДНК находится в прямой зависимости от напряженности электрического поля, при которой проводится электрофорез. Чем меньше напряженность поля, тем более эффективно можно разделить длинные молекулы ДНК с большей молекулярной массой.

Разделение одноцепочечных ДНК

В процессе разделения в 1% агарозном геле одноцепочечная ДНК в электрическом поле движется быстрее (примерно на 10%), чем двухцепочечная ДНК того же размера. Однако, одноцепочечная ДНК окрашивается бромистым этидием заметно слабее, чем двухцепочечная (примерно в 4-5 раз). В связи с этим, для получения окраски полос одинаковой интенсивности, необходимо использовать примерно в 5 раз большее количество образца одноцепочечной ДНК.

Для разделения цепей ДНК нужно непосредственно перед электрофорезом прогреть испытуемые образцы около 1 мин при температуре 100°C или добавить к образцу раствор натрия гидроксида до получения концентрации 0,1 М раствора и выдержать около 5-10 мин при комнатной температуре или при температуре 37°C.

В качестве маркеров для одноцепочечных ДНК возможно использование фрагментов двухцепочечных ДНК с известными размерами, подвергнутых денатурации при высокой температуре, а также коммерческих одноцепочечных маркеров.

Напряжённость электрического поля

При оценке напряженности электрического поля для горизонтального электрофореза принято пренебрегать конкретной геометрией камеры и измерять расстояние непосредственно между электродами.

Для аналитических электрофорезов приемлемое качество сохраняется при напряженности электрического поля до 6 В/см.

ДНК особенно легко теряет бромистый этидий при повышенной температуре. Проведение электрофореза при высоком напряжении электрического поля может достаточно сильно нагреть гель. Но даже при невысоких значениях напряжения в электрическом поле происходит выделение тепла, поэтому следует обеспечивать теплоотвод и стабильность температурного режима (комнатная температура) с целью исключения изменений вязкости геля, проводимости и скорости потока и, следовательно, искажения зон анализируемых компонентов.

Примечания

Приготовление трис-боратного буферного раствора pH 8,0. В мерную колбу вместимостью 1 л вносят 10,8 г трис(гидроксиметил)аминометан, 5,5 г борной кислоты, 4 мл 0,05 М раствора ЭДТА pH 8.0 и 700 мл воды очищенной, перемешивают, доводят объем раствора водой очищенной до метки и вновь перемешивают.

Приготовление буферного раствора для внесения pH 8,0. В мерную колбу вместимостью 25 мл вносят 1,25 мл 0,5% раствора натрия додецилсульфата, 5 мл 0,1 М раствора ЭДТА pH 8.0, 12,5 мл глицерина, 6,25 мл воды очищенной и тщательно перемешивают. Перед использованием отбирают необходимое количество буферного раствора, разводят в 10 раз водой очищенной, добавляют выбранный краситель (например, бромфеноловый синий) до необходимой концентрации, указанной в нормативной документации и перемешивают.