Спектрофотометрический метод

Спектрофотометрический метод основан на способности фенола поглощать свет в ультрафиолетовой области. Определение фенола проводится спектрофотометрическим методом. По результатам измерения оптической плотности растворов при 269 нм (максимум поглощения фенола) и 290 нм (максимум поглощения окрашенных примесей) определяется содержание фенола по калибровочному графику.

Готовят 10 мл разведенного испытуемого образца и измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов в кюветах с толщиной слоя 10 мм при 269 нм и 290 нм по сравнению с контрольным раствором (вода очищенная). Рассчитывают разность между показателем оптической плотности при 269 нм и 290 нм и по калибровочному графику определяют количество фенола в разведенном образце в мкг/мл.

Количество фенола (Х) в исходном образце в мг/мл вычисляют по формуле:

,

где: а - количество фенола, найденное по калибровочному графику, мкг/мл;

100 - разведение испытуемого раствора;

1000 - пересчет в мг.

Содержание фенола в биологических лекарственных препаратах (БЛП) должно составлять от 1,5 до 4,0 мг/мл.

Построение калибровочного графика. К 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 мл стандартного раствора В прибавляют воду очищенную до объема 5 мл и перемешивают (концентрация фенола соответственно: 10; 20; 30; 40; 50 мкг/мл), далее анализ проводят, как указано выше. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество мкг фенола, а по оси ординат - среднее значение разности между показателем оптической плотности при 269 нм и 290 нм .

Примечания

Приготовлние испытуемого раствора. К 0,1 мл испытуемого образца добавляют 9,9 мл воды очищенной и перемешивают.

Приготовление основного стандартного раствора фенола 10 мг/мл (раствор А). Помещают 1,0000 г (точная навеска) фенола в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре 4 - 8°С в течение 1 г.

Приготовление стандартного раствора фенола 100 мкг/мл (раствор В). Наливают 0,1 мл стандартного раствора А в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в склянке из темного стекла при температуре 4 - 8°С в течение 3 мес.

Метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Для определения содержания фенола в БЛП необходимо соблюдать следующие хроматографические условия:

- Колонка с неподвижной фазой ;

- Подвижная фаза: смесь ацетонитрила или метанола с ледяной уксусной кислотой;

- Температура колонки: 20 - 25°С;

- УФ детектор - длина волны 269 нм или 270 нм;

- Скорость потока - в зависимости от параметров хроматографической колонки (рекомендуемая величина - 0,8 - 1,2 мл/мин).

Порядок проверки пригодности хроматографической системы

Для проверки пригодности хроматографической системы вводят следующие пробы: 20 мкл разводящего раствора (1 инжекция), по 20 мкл рабочего стандартного раствора фенола 0,1 мг/мл (6 инжекций).

Хроматографическая система считается пригодной при соблюдении следующих условий:

1. хроматограмма разводящего раствора ("холостой" опыт) не должна содержать пики, перекрывающиеся с пиками определяемого вещества;

2. относительное стандартное отклонение площади пика фенола в 6 измерениях должно быть не более 3%;

3. коэффициент асимметрии пика фенола должен быть не более 2;

4. число теоретических тарелок пика фенола должно быть не менее 5000.

Порядок измерений

Проводят измерения проб в следующей последовательности: рабочие стандартные растворы фенола 10; 20; 30 мкл (отбор проб в хроматографической системе производится автоматически и при введении стандартных образцов количество фенола изменяется за счет изменения объема). Затем вводят 20 мкл испытуемого раствора. Измерения всех испытуемых проб проводят в двух повторностях. Для вычисления содержания фенола используют среднее значение.

Содержание фенола (Х) в испытуемом образце в мг/мл вычисляют по формуле:

,

где:

S - значение площади пика фенола на хроматограмме испытуемого раствора, найденное по графику;

b - свободный коэффициент уравнения регрессии;

a - угловой коэффициент уравнения регрессии;

25 - степень разведения испытуемого образца.

Построение калибровочного графика. Для определения отбирают 10; 20; 30 мкл рабочего стандартного раствора фенола (0,1 мг/мл) с ожидаемым содержанием фенола 0,05; 0,1 и 0,15 мг (точное значение количества фенола рассчитывают с учетом навески, взятой для приготовления основного стандартного раствора фенола). Проводят измерения в последовательности, указанной выше. Строят график регрессионной зависимости площади пика от концентрации фенола с помощью программного обеспечения к прибору.

Метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) применим для БЛП с содержанием фенола от 1 до 4,0 мг/мл.

Примечания

1. Приготовление испытуемого раствора. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл раствора образца, доводят объем раствора до метки водой очищенной или другим растворителем, указанным в нормативной документации, и перемешивают. Раствор хранят в течение 7 сут при комнатной температуре.

2. Приготовление 0,5% раствора уксусной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл, вносят 700 мл воды очищенной, добавляют 5 мл ледяной уксусной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

3. Приготовление разводящего раствора (подвижная фаза): Ацетонитрил для ВЭЖХ разводят 0,5% раствором уксусной кислоты в соотношении 1:4.

4. Приготовление основного стандартного раствора фенола (1 мг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 60 мл разводящего раствора, добавляют 0,1000 г (точную навеску) фенола и перемешивают, затем доводят объем раствора до метки тем же раствором и вновь перемешивают. Раствор хранят в течение 7 сут при комнатной температуре.

Приготовление рабочего стандартного раствора фенола (0,1 мг/мл). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мл основного стандартного раствора фенола, доводят объем раствора разводящим раствором до метки и перемешивают. Раствор хранят в течение 7 сут при комнатной температуре.