-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 31.10.2018 № 749 |
Дата введения в действие: | c 01.12.2018 |
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания |
Раздел: | 1.7.2. Методы анализа биологических лекарственных препаратов |
Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
Номер: | ОФС.1.7.2.0005.15 |
Внутр.№: | 2338.1 |
Статус: | Действующая статья |
Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин |
Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella pertussis 18323 по методу Kendrick.
Животные. Здоровые мыши с массой тела г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10% мышей данную партию не используют.
- стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в МЕ по соответствующему международному стандартному образцу;
- стандартный образец мутности 10 МЕ, калиброванный в международных оптических единицах (МЕ).
Тест-штамм. B. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.
Среды. Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.
В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:
- калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,25 г,
- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,75 г,
- магний сернокислый - 0,075 г,
Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь рН 7,4-7,5.
Затем в солевой раствор вносят:
- фильтрат картофельного отвара - 500 мл,
- агар зарубежных фирм "Дифко" (США) или "Мерк" (Германия) - 60 г.
Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают рН 7,1-7,2, разливают по мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110°С в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8°С не более 3 мес.
В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля втечение 1,0-1,5 ч. Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.
Для получения среды Борде-Жангу с 30% крови содержимое флакона нагревают до температуры 50-55°С, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью - 10 сут при температуре от 2 до 8°С.
Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ "Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови" и "Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза". Срок хранения крови не более 2 сут.
- гидролизат казеина - мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до 160 мг %),
- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,
- магний хлористый 6-водный - 0,4 г,
- крахмал растворимый - 1,5 г,
- кальций хлористый - 0,01 г или 1% раствор - 1 мл,
- железо сернокислое 7-водное - 0,01 г или 0,5% раствор - 2 мл,
- медь сернокислая 5-водная - 0,005 г или 0,2% раствор - 2 мл,
- цистеин -0,03 г или 1,5% раствор - 2 мл,
- агар микробиологический - 30,0 г,
Содержание хлоридов в среде должно составлять %, аминного азота ( мг %); рН среды доводят до 7,0-7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида.
Среду разливают в матрацы по мл, пробирки по мл и флаконы вместимостью 500 мл по мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110°С и хранят при температуре от 2 до 8°С не более 1 мес. Для получения среды с 10% крови содержимое флакона растапливают, охлаждают до температуры 50-55°С, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8°С.
- хлористоводородная кислота концентрированная - 1000 мл,
Степень расщепления белка - не менее 93%. Аминный азот 850-1000 мг %, общий азот 910-1080 мг %, натрия хлорид 4-6%. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110°С. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5% хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8°С).
- дрожжи хлебопекарные - 1000 г,
- Аминный азот - не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8°С.
1% раствор гидролизата казеина
Гидролизат казеина - 10 мл (аминный азот 8,5-10,0 мг/мл), натрий хлористый - 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6%), вода очищенная - до 1000 мл. С помощью 20% раствора натрия гидроксида рН доводят до . Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121°С. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.
Мышей распределяют в группы по 18-20 животных в каждой: по 3 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма B. pertussis 18323 (определение культуры) из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.
Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.
Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида, рН . В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза .
В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 МЕ (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).
Таблица 1- Пример разведения референс-препарата
Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.
Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8°С и используют в течение не более 4 ч.
Таблица 2 - Пример разведения испытуемой вакцины
Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94% иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.
Бактериальную суспензию B. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго-третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.
Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки B. pertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.
Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 МЕ по стандартному образцу мутности (разведение ). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, рН .
Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100-1000 ) . Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).
Таблица 3 - Пример разведения тест-штамма B. pertussis 18323
Объем переносимой суспензии из предыдущей пробирки в последующую, мл |
|||||
Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой °С на 3-4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчёт выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.
При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.
Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100-1000 в объеме 0,03 мл.
Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14-17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма B. pertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу N 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.
Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.
За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.
Вычисление величины (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:
где: - максимальная из
испытуемых доз;
- логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);
Li - отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;
- сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.
Таблица 4 - Пример расчета величины культуры тест-штамма B. pertussis 18323
Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных |
|||||
В заражающей дозе ( микробных клеток) содержится 648=154
Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n=16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (А), по горизонтальной оси - разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (В). В месте пересечения прямых, проведённых от соответствующих величин А и В, находят (верхняя цифра) и её стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины в опыте, найденную в таблице величину делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы не ниже 64% и не выше 157% от найденного значения .
Примеры расчета количества МЕ в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.
Таблица 6 - Пример расчета иммуногенной активности вакцины
Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 МЕ (табл. 6). При определении референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в МЕ.
Количество МЕ в 1 мл вакцины определяют по формуле:
Доверительный интервал значения иммуногенности (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:
где R - количество МЕ в 1 мл препарата;
- нижний предел доверительного интервала;
- верхний предел доверительного интервала;
K - доверительный коэффициент.
где - для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия - 95 или 99%;
- для менее иммуногенного препарата.
Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 МЕ с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 МЕ.
Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества МЕ в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Хгеом.) величины значения по формуле:
где - произведение усредняемых величин;
- референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами;
- не превышает 1000 микробных клеток;
- заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 ;
- в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.