|
Определение
содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и
лекарственных растительных препаратах
|
ОФС.1.5.3.0009.15
|
Требования настоящей общей фармакопейной статьи распространяются на
методы количественного определения тяжелых металлов: свинца, кадмия, ртути и
мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных
препаратах.
Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном
растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят с
использованием одного из следующих методов:
- атомно-абсорбционной спектрометрии;
- атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой;
- масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой.
Результаты, полученные при определении содержания тяжелых металлов и
мышьяка в лекарственном растительном сырье, распространяются на лекарственный
растительный препарат, произведенный из данной партии лекарственного
растительного сырья.
Лекарственные растительные препараты подвергаются выборочному
контролю на содержание тяжелых металлов и мышьяка не реже одного раза в год
(одна серия каждого наименования).
Процедура определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в
лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах
состоит из следующих основных этапов:
1. Отбор пробы для определения остаточных пестицидов, тяжелых
металлов и мышьяка. Отбор пробы проводится в соответствии с требованиями ОФС "Отбор проб
лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных
препаратов" в условиях, исключающих дополнительное загрязнение сырья.
2. Подготовка пробы.
3. Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в испытуемых
пробах.
4. Определение соответствия сырья допустимым нормам.
Оборудование, реактивы, растворы
Для определения содержания тяжелых металлов и мышьяка в
лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах
используют оборудование, отвечающее требованиям ОФС на соответствующие методы
анализа.
При выполнении исследований используют реактивы, предназначенные для
спектральных методов анализа или марки "ос.ч.".
Приготовление растворов осуществляют в мерной посуде класса А или 1
класса точности, а их хранение - в пластиковой посуде (PMP, PFA, PP).
Используемая вода должна быть деионизированной на ионообменных
смолах и соответствовать требованиям, предъявляемым к воде очищенной.
Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка
методом атомно-абсорбционной спектрометрии
Аппаратура для метода атомно-абсорбционной
спектрометрии
Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном
растительном сырье и лекарственных растительных препаратах проводят на
атомно-абсорбционном спектрометре с различными атомизаторами пробы (пламенный, электротермический),
а также методом "холодного пара" и генерации гидридов.
Подготовка лабораторной посуды включает следующие последовательные
этапы: обычная мойка посуды с раствором моющего средства, тщательное
ополаскивание проточной водой питьевой, затем замачивание в натрия гидроксида
растворе 1% и водорода пероксиде, ополаскивание проточной водой питьевой с
последующим замачиванием в течение 1 ч в хлористоводородной кислоты растворе
10%, либо обработка посуды азотной кислоты раствором 1%, ополаскивание водой
для хроматографии 3-4 раза, сушка.
Приготовление стандартных растворов тяжелых металлов и мышьяка
осуществляют в лабораторных условиях или используют готовые растворы
стандартных образцов.
Подготовка проб к анализу
Пробоподготовка включает в себя предварительное измельчение пробы
для определения остаточных пестицидов, тяжелых металлов и мышьяка с целью
приготовления однородного образца и последующего взятия не менее двух
параллельных навесок, деструкцию органической матрицы для переведения ионов
металлов и мышьяка в раствор.
При отборе проб следует избегать контакта лекарственного
растительного сырья и препаратов с предметами, содержащими определяемые
металлы. Загрязнение лабораторной посуды железом, хромом и никелем может
происходить при контакте с нержавеющей сталью, свинцом - с резиной, кадмием - с
некоторыми видами пластмасс. Эти загрязнения контрольным опытом не учитываются
и могут давать заметное завышение результатов.
Пробу сырья предварительно измельчают с помощью ножа или ножниц,
затем в специальных лабораторных дробилках или мельницах-измельчителях и
просеивают сквозь сито с размером отверстий 1 мм (ОФС
"Оборудование"). Лекарственные растительные препараты, расфасованные
в пачки, дополнительно измельчают и просеивают сквозь сито с размером отверстий
1 мм.
Лекарственные растительные препараты, расфасованные в фильтр-пакеты,
дополнительно измельчают и просеивают сквозь сито с размером отверстий
1 мм.
Для дальнейшей подготовки к анализу рекомендуется использовать два
метода подготовки пробы:
- сухая минерализация;
- мокрая минерализация.
Пробоподготовка сырья и препаратов к анализу заключается в
деструкции органической основы пробы методами "сухой" (термической)
минерализации, "мокрой" (кислотной) минерализации с последующим
растворением остатка в водных растворах кислот или кислотной экстракции
(неполной минерализации). При недостаточной чувствительности проводят концентрирование
токсичных элементов с последующим атомно-абсорбционным определением их в
органических растворах.
Метод "сухой" минерализации основан на полном разложении
органических веществ путем сжигания анализируемой пробы в муфельной печи при
контролируемом температурном режиме.
Метод "мокрой" минерализации основан на полном разложении
органических веществ пробы при нагревании в смеси концентрированных кислот.
Проведение "мокрой" минерализации возможно в открытых системах
(колбах Кьельдаля, стеклянных стаканах), либо в закрытых системах (например,
автоклав, микроволновая система для пробоподготовки).
Метод пробоподготовки лекарственного растительного сырья и
препаратов к анализу выбирают в соответствии с аппаратурным оснащением
аналитической лаборатории. Для арбитражного контроля используют метод
"мокрой" минерализации (с использованием микроволновой системы для
пробоподготовки). Параллельно проводят холостой опыт.
Метод 1а ("сухая" минерализация, Pb, Cd)
Около 2,5 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают в фарфоровый, стеклоуглеродный, кварцевый или другой
тигель и ставят в холодную муфельную печь. Озоление образцов проводят
постепенно, поднимая температуру печи на 50°С каждые 30 мин (во избежание
воспламенения) до 480°С, выдерживают в печи до полного озоления образца. После
охлаждения пробу переносят во фторопластовый стакан, прибавляют 5 мл
азотной кислоты концентрированной, свободной от свинца и кадмия, и оставляют на
ночь. Затем нагревают пробу на электрической плитке и выпаривают до сухого
остатка, после чего добавляют 1 мл фтористоводородной кислоты
концентрированной и при сильном нагреве выпаривают досуха. Остаток охлаждают и
обрабатывают 10 мл хлористоводородной кислоты разведенной (1:1) и
упаривают до "влажных солей". Остаток доводят хлористоводородной
кислоты раствором 2,5% до объема 10 мл.
Метод 1б ("сухая" минерализация, Pb, Cd)
Около 0,5-1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают в тигель (из стеклоуглерода марки С-200, разрешается
использование кварцевых и платиновых тиглей, фарфоровых с неповрежденной
внутренней поверхностью), смачивают 0,5-1,5 мл серной кислоты
концентрированной и осторожно нагревают на пламени газовой горелки,
электрической плитке и др. до полного обугливания. Затем тигель охлаждают до
комнатной температуры и прибавляют к его содержимому 1 мл азотной кислоты
концентрированной и 5 капель серной кислоты концентрированной. После этого
осторожно нагревают на электрической плитке до исчезновения бурых паров,
избегая разбрызгивания, потом усиливают нагрев до исчезновения плотных белых
паров. Затем тигель помещают в муфельную печь и прокаливают при температуре
около 500°С до получения зольного остатка. После чего тигель охлаждают до
комнатной температуры и к его содержимому прибавляют 4 мл
хлористоводородной кислоты раствора 6 М, закрывают крышкой и нагревают на
кипящей водяной бане 15 мин. Затем крышку снимают и осторожно упаривают
содержимое тигля до "влажных солей", после чего прибавляют 1 каплю
хлористоводородной кислоты концентрированной и 5 мл горячей воды и
нагревают в течение 2 мин. Полученный остаток количественно (трехкратно)
переносят небольшими порциями при помощи воды для хроматографии в мерную колбу
вместимостью 25 или 50 мл, фильтруя через беззольный фильтр, промытый
хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, и доводят водой для хроматографии
до метки и перемешивают.
Метод 2a ("мокрая" минерализация, Pb, Cd)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают в колбу Кьельдаля вместимостью 100 мл, прибавляют
7 мл азотной кислоты концентрированной, перемешивают до полного смачивания
пробы. После этого к содержимому прибавляют 4 мл хлорной кислоты
концентрированной и перемешивают. Колбу закрепляют под углом 45° на песчаной
бане, осторожно нагревают до появления бурых паров азота оксида и нагрев
отключают. После полного прекращения выделения бурых паров температуру повышают
до появления плотных белых паров и получения кислотного остатка 1-2 мл,
колбу снимают с песчаной бани, охлаждают и количественно при помощи воды для
хроматографии переносят ее содержимое в мерную колбу вместимостью 50 или
100 мл, фильтруя содержимое через беззольный фильтр (промытый
хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М), доводят объем раствора водой до
метки и перемешивают.
Метод 2б ("мокрая" минерализация, Hg)
Около 0,5 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают в стеклянный стакан вместимостью 50 мл, смачивают
водой, приливают 6 мл серной кислоты концентрированной и 3 мл азотной
кислоты концентрированной. Перемешивают, стакан накрывают крышкой из
стеклоуглерода и оставляют в водяной бане на 1 сут при температуре около
10-20°C, затем переносят на водяную баню и нагревают при температуре 50-60°С в
течение 2 ч. После этого стакан охлаждают до комнатной температуры, снимают
крышки из стеклоуглерода и прибавляют 5 мл аммония персульфата раствора
5%. Смесь перемешивают и оставляют в стакане на ночь при комнатной температуре.
На следующий день содержимое стакана переносят в мерную колбу вместимостью 200
или 250 мл и проводят дальнейшее определение.
Метод 2в ("мокрая" минерализация, Hg)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают во фторопластовый стакан металлического тубуса,
смачивают 6 мл смеси серной кислоты концентрированной и азотной кислоты
концентрированной в соотношении 1:5. Стакан, закрытый фторопластовой крышкой,
помещают в металлический тубус. Металлический тубус закрывают, помещают в
сушильный шкаф, нагревают до 100°С и выдерживают при этой температуре в течение
4 ч, далее его вынимают, охлаждают, вскрывают и количественно переносят
содержимое фторопластового стакана в мерную колбу вместимостью 200 или
250 мл, и проводят определение.
Метод 2г ("мокрая" минерализация, Pb, Cd,
As)
Около 1,0 г (точная навеска) лекарственного растительного
сырья/препарата помещают во фторопластовый стакан автоклава, смачивают
10 мл смеси хлористоводородной кислоты концентрированной и азотной кислоты
концентрированной в соотношении 1:1. Стакан, закрытый фторопластовой крышкой,
помещают в автоклав. Автоклав закрывают, помещают в сушильный шкаф, нагревают
до 200°С и выдерживают при этой температуре 2 ч. Далее автоклав вынимают,
охлаждают, вскрывают и количественно переносят содержимое фторопластового
стакана в мерную колбу вместимостью 50 мл, фильтруя содержимое через
беззольный фильтр, промытый хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, доводят
объем раствора водой до метки и перемешивают.
Метод 2д ("мокрая" минерализация, Pb, Cd,
Hg, As)
Мокрую минерализацию проводят в системе микроволнового разложения.
Разложение в микроволновой системе возможно в различном аппаратурном исполнении
при использовании различных кислот и реагентов. При использовании таких систем
нужно придерживаться рекомендаций фирмы-изготовителя. Необходимо валидировать
методику разложения лекарственного растительного сырья и лекарственных
растительных препаратов.
В качестве примера приводится следующая методика.
Около 0,5 г (точная навеска) измельченного лекарственного
растительного сырья/препарата помещают в сосуд для микроволнового разложения,
приливают 3 мл воды и 5 мл азотной кислоты концентрированной,
осторожно перемешивают до полного смачивания и выдерживают в течение 5-10 мин.
Сосуд герметично закрывают, помещают его в защитный кожух и затем в ротор
микроволновой системы. Далее проводят обработку по программе, приведенной в табл. 1.
Таблица 1 -
Программа обработки образцов лекарственного растительного сырья/препарата в
системе микроволнового разложения
|
Этап
|
Время, мин
|
Температура,
°С
|
Мощность
излучения, Вт
|
|
1
|
5
|
80
|
до 350
|
|
2
|
3,5
|
160
|
до 800
|
|
3
|
4,5
|
190
|
до 1000
|
|
4
|
12
|
190
|
до 800
|
В конце цикла сосуды охлаждают на воздухе, открывают и полученный
прозрачный или с небольшим осадком раствор количественно переносят в мерную
колбу вместимостью 25 мл, фильтруя через беззольный фильтр, промытый
хлористоводородной кислоты раствором 0,1 М, затем доводят объем раствора водой
до метки и перемешивают.
Допускается проведение пробоподготовки с использованием систем для
минерализации проб (микроволновые, автоклавные и т.д.) с валидацией по образцам
с известным содержанием элементов.
Проведение измерений
Измерения проводят различными вариантами метода атомно-абсорбционной
спектрометрии с разными способами атомизации пробы. Чувствительность измерения
в атомно-абсорбционном анализе для пламенного метода составляет
0,01-10 мкг/мл, для непламенных - 0,0001 - 0,1 мкг/мл. Ртуть определяют
методом атомно-абсорбционной спектрометрии с применением техники "холодных
паров".
Анализ проб на содержание свинца и кадмия осуществляют пламенным
вариантом (табл. 2), свинца, кадмия и мышьяка с использованием
электротермического атомизатора (табл. 3); ртути - на ртутном анализаторе или с
использованием ртутно-гидридной приставки к атомно-абсорбционному спектрометру,
мышьяка - с использованием ртутно-гидридной приставки к атомно-абсорбционному
спектрометру в соответствии с условиями анализа элементов (табл. 2).
Таблица 2 - Ориентировочные параметры определения тяжелых
металлов и мышьяка методом атомно-абсорбционной спектрометрии (пламенный
вариант)
|
Металл
|
Длина
волны, нм
|
Ширина
щели, нм
|
Тип пламени
|
Чувствительность, мкг/мл
|
|
Кадмий
|
228,8
|
0,3
|
В - А
|
0,025
|
|
Свинец
|
283,3
|
0,4
|
В - А
|
0,50
|
|
Ртуть
|
253,7
|
0,7
|
"холодный
пар"
|
0,002
|
|
Мышьяк
|
193,7
|
0,5
|
|
0,002
|
Примечание: тип пламени: В
- воздух, А - ацетилен в соответствии с требованиями инструкции по эксплуатации
фирмы - изготовителя.
Обработку полученного аналитического сигнала для ртути и мышьяка
осуществляют по высоте пика.
Стадия высушивания зависит от кислотного, органического,
минерального состава пробы и конструктивных особенностей прибора.
Обработку полученного аналитического сигнала для кадмия, свинца и
мышьяка осуществляют по площади пика.
Параметры определения тяжелых металлов и мышьяка со стадиями
высушивания, озоления (пиролиза), атомизации и отжига (очистки) исследуемых
проб отрабатываются для конкретных приборов в соответствии с инструкцией по
эксплуатации прибора.
Таблица 3 - Ориентировочные параметры определения тяжелых
металлов и мышьяка методом атомно-абсорбционной спектрометрии
(электротермический вариант)
|
Металл
|
Длина
волны, нм
|
Ширина
щели, нм
|
Стадия
озоления (пиролиза)
|
Стадия
атомизации
|
|
Т, °С
|
 ,
с
|
Т, °С
|
,
с
|
 ,
c
|
|
|
Кадмий
|
228,8
|
0,20-0,5
|
300-600
|
8-25
|
1300-1700
|
3-5
|
3-5
|
|
Свинец
|
283,3
|
0,20-0,5
|
500-800
|
8-25
|
1600-2000
|
3-5
|
3-5
|
|
Мышьяк*
|
193,7
|
0,20-0,5
|
800-1400
|
8-15
|
2200-2600
|
3-5
|
3-5
|
Примечание: Т, °С -
температура озоления, атомизации; ,
с - время озоления, атомизации; ,
с - время интегрирования;
──────────────────────────────
* при использовании корректора Зеемана.
──────────────────────────────
Для уменьшения влияния минерального состава лекарственного
растительного сырья или препарата на исследуемые элементы используют:
1. Кювету с пластиной (платформой).
2. Модификаторы матрицы.
3. Разбавление анализируемого раствора.
Подготовку атомно-абсорбционного спектрометра к работе осуществляют
в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора с учетом особенности
измерения низких концентраций элементов.
Результатом измерений является величина атомного поглощения
элемента, полученная в абсорбционном режиме с доверительной вероятностью
Р=0,95.
Обработка результатов измерений и определение
соответствия тяжелых металлов в сырье допустимым нормам
Обработку результатов проводят с использованием компьютерных
программ. При ручной обработке данных строят график зависимости абсорбции от концентрации.
Допускается применять линейную, кусочно-линейную или сглаженную нелинейную
аппроксимацию градуировочной функции с коэффициентом корреляции не менее 0,990.
В расчетах используют среднее арифметическое значение 3 параллельных измерений.
Результаты определения содержания тяжелых металлов в испытуемом
образце (С) следует считать как среднее арифметическое 3 параллельных
определений с точностью до 0,001 мкг.
Содержание металла в испытуемом лекарственном растительном
сырье/препарате (Х) в мкг/г вычисляют по формуле:
,
где 
-
концентрация металла в испытуемом растворе, мкг/мл;
V - разведение, мл;
-
концентрация металла в контрольном опыте, мкг/мл;
-
объем контрольной пробы, мл;
a - навеска сырья/препарата, г.
Методики определения тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном
растительном сырье и лекарственных растительных препаратах должны быть
валидированы. Выбор методики измерения аналитического сигнала (по
градуировочной кривой или методом "стандартных добавок") для
конкретных объектов исследования определяется в ходе валидации методики.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ СПОСОБЫ ПРОБОПОДГОТОВКИ И ПРОВЕДЕНИЯ
РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
При проведении определения содержания тяжелых металлов в
лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах
методами атомно-абсорбционной спектрометрии; атомно-эмиссионной спектрометрии с
индуктивно связанной плазмой; масс-спектрометрии с индуктивно связанной
плазмой; рентгенофлуоресцентной спектрометрии могут быть использованы способы
пробоподготовки и проведения результатов измерений, приведенные ниже.
Метод 1 (сухая минерализация)
Метод соответствует методу 1б ("сухая" минерализация, Pb,
Cd), приведенному в разделе "Подготовка проб к анализу" для
атомно-адсорбционной спектрометрии.
Метод 2 (мокрая минерализация)
Метод соответствует методу 2д ("мокрая" минерализация, Pb,
Cd, Hg, As), приведенному в разделе "Подготовка проб к анализу" для
атомно-адсорбционной спектрометрии.
Проведение измерений
Определение содержания кадмия, ртути, мышьяка, свинца проводят
методом калибровочной кривой или методом стандартных добавок в соответствии с
требованиями ОФС.1.2.1.1.0004.15 "Атомно-эмиссионная спектрометрия".
Приготовление стандартных растворов
Для приготовления стандартных растворов используют готовые растворы
стандартных образцов (ГСО) состава ионов металлов отечественного или
зарубежного производства (CRM) с аттестованными значениями концентраций
элементов в азотной или хлористоводородной кислоте с массовой долей кислоты не
менее 1%.
Измерения для каждого холостого, калибровочного и испытуемого
раствора выполняют не менее 5 раз.
За результат измерений принимают среднее арифметическое 3
параллельных определений одной пробы.
Допускается применять линейную, кусочно-линейную или сглаженную
нелинейную аппроксимацию градуировочной функции с коэффициентом корреляции не
менее 0,990.
Предельно допустимое содержание тяжелых металлов и мышьяка* не
должно превышать значений, приведенных в табл. 4 (если не
указано иное в фармакопейной статье или нормативной документации).
Таблица 4 - Предельно допустимое содержание тяжелых
металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных
растительных препаратах
|
Элемент
|
Предельно
допустимое содержание, мг/кг
|
|
Свинец
|
6,0
|
|
Кадмий
|
1,0
|
|
Ртуть
|
0,1
|
|
Мышьяк*
|
0,5
|
Примечание - В
соответствии с требованиями безопасности, принятыми в Российской Федерации.