Молекулярно-массовое распределение декстранов

ОФС.1.2.1.0028.18   Вводится впервые

 

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод изучения молекулярно-массового распределения и определения средней молекулярной массы декстранов 40, 60 и 70. Определение проводят методом гель-фильтрационной хроматографии в соответствии c ОФС "Эксклюзионная хроматография" и согласно условиям, описанным ниже.

 

Методика

 

Испытуемый раствор. Раствор испытуемого декстрана в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Маркерный раствор для определения рабочего объема колонки. 5 мг глюкозы и 2 мг СО высокомолекулярного декстрана ( кДа) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Калибровочные растворы. Из отдельных навесок СО декстранов для калибровки c различными молекулярными массами готовят серию калибровочных растворов в подвижной фазе (концентрация декстрана 20 мг/мл), соответствующих калибровочному диапазону для среднемассовой молекулярной массы от 4 до 250-270 кДа. Серия калибровочных растворов должна включать в себя не менее 5 растворов, приготовленных с использованием узкодисперсных СО декстранов для калибровки, охарактеризованных по значениям среднемассовой молекулярной массы () и массы, соответствующей максимуму хроматографического пика (, ).

Раствор для проверки пригодности системы. Раствор СО декстрана 40 для проверки пригодности системы, или СО декстрана 60/70 для проверки пригодности системы, или СО декстрана 70 для проверки пригодности системы (в соответствии с испытуемым декстраном) в подвижной фазе с концентрацией 20 мг/мл.

Условия хроматографического анализа.

Подвижная фаза: 7,1 г/л (50 мМ) раствор натрия сульфата безводного в воде с добавкой 0,2 г/л (0,02%) натрия азида.

Детектирование: дифференциальное рефрактометрическое.

Температура оптического блока детектора: 40°С.

Хроматографические колонки: три последовательно соединенные хроматографические колонки (длина 300 мм, внутренний диаметр 7,5-8 мм), заполненные частицами гидроксилированного полиметакрилата (7-17 мкм): две колонки, заполненные частицами диаметром 10-17 мкм (размер пор 1000 ; предел эксклюзии, определенный по декстрану,  2500-4000 кДа), одна колонка, заполненная частицами диаметром 7-17 мкм (размер пор 200 ; предел эксклюзии, определенный по декстрану,  60-100 кДа).

Скорость потока подвижной фазы: 0,5-1,0 мл/мин.

Температура колонок: 25°С.

Объем вводимой пробы: 50-100 мкл.

Время хроматографирования: в 1,1 раза больше времени удерживания пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки.

 

Калибровка системы

 

Хроматографируют маркерный раствор для определения рабочего объема колонки, получая не менее 3 последовательных хроматограмм. На хроматограмме должны присутствовать два основных пика: первый пик соответствует высокомолекулярному декстрану, второй пик соответствует глюкозе. Объем элюирования пика высокомолекулярного декстрана (определенный в вершине пика) соответствует "мертвому" объему колонки (), а объем элюирования пика глюкозы соответствует полному объему элюента в колонке ().

Хроматографируют каждый из калибровочных растворов. На каждой полученной хроматограмме аккуратно интегрируют пик декстрана. Каждый пик декстрана, а также пик глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки, делят равноудаленными перпендикулярами на p частей (), соответствующих равным объемам элюирования. Разбиение пиков на части и все последующие расчеты молекулярно-массового распределения, согласно представленному ниже алгоритму, выполняют, используя специализированное программное обеспечение в автоматическом режиме.

Для каждой i-ой части пика (), соответствующей объему элюирования , измеряют высоту () от базовой линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения () по формуле (1):

 

,

(1)

 

где  - "мертвый" объем (предел эксклюзии) колонки, определенный по пику высокомолекулярного декстрана на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

 - полный объем элюента в колонке, определенный по пику глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки;

 - объем элюирования i-ой части пика декстрана на хроматограммах каждого из калибровочных растворов (или i-ой части пика глюкозы на хроматограмме маркерного раствора для определения рабочего объема колонки).

 

Аналогичным образом для пиков каждого из калибровочных декстранов и глюкозы по формуле (1) рассчитывают коэффициент распределения , соответствующий вершине пика. Используя подходящее программное обеспечение строят зависимость полученных значений  (ось абсцисс) от заявленной молекулярной массы в максимуме пика () каждого из декстранов, использованных для калибровки, и глюкозы (ось ординат). Полученную зависимость аппроксимируют уравнением вида (2). Используя значения , рассчитанные по уравнению (1) для соответствующих частей пиков калибровочных декстранов и глюкозы, вычисляют значения , а затем, значения  по уравнениям (2) и (3).

 

,

(2)

 

,

(3)

 

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

 - высота i-ой части пика над базовой линией;

 - молекулярная масса i-ой части пика;

 - расчетное значение среднемассовой молекулярной массы.

Рассчитанные значения  для калибровочных декстранов и глюкозы сравнивают с паспортными значениями. При необходимости, используя подходящие программное обеспечение и алгоритм аппроксимации калибровочной кривой нелинейным методом наименьших квадратов (например, методом Гаусса-Ньютона), выполняют итерационный подбор коэффициентов  в уравнении (2), добиваясь выполнения условий пригодности калибровки (см. раздел "Проверка пригодности системы и калибровки").

 

Проверка пригодности системы и калибровки

 

Хроматографируют раствор для проверки пригодности системы и рассчитывают значение среднемассовой молекулярной массы декстрана по уравнениям (2) и (3), как описано выше.

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% высокомолекулярной фракции декстрана по уравнению (4):

 

, где

(4)

 

n определяется из выражений (5) и (6):

 

,

(5)

 

,

(6)

 

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

 - высота i части пика над базовой линией;

 - молекулярная масса i части пика.

 

Рассчитывают среднемассовую молекулярную массу 10% низкомолекулярной фракции декстрана по уравнению (7):

 

, где

(7)

 

n определяется из выражений (8) и (9):

 

,

(8)

 

,

(9)

 

где p - число частей, на которые поделен хроматографический пик;

 - высота i части пика над базовой линией;

 - молекулярная масса i части пика.

 

Хроматографическая система и калибровка считаются пригодными, если:

- относительное стандартное отклонение для значений ,  и отношения , рассчитанное по серии последовательных хроматограмм () раствора для определения рабочего объема колонки не превышает 1%;

- фактор асимметрии, рассчитанный для пика глюкозы, не превышает 1,3;

- рассчитанные значения  отличаются от соответствующих сертифицированных значений  в пределах  для каждого стандартного образца декстрана, а расчетное значение  глюкозы составляет  Да. При этом среднее значение отклонения Mw декстранов, рассчитанное из модулей индивидуальных отклонений, не должно превышать 3%;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 39000 до 47000 Да в случае СО декстрана 40 для проверки пригодности; от 67000 до 75000 Да в случае СО декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 65000 до 74000 Да в случае СО декстрана 70 для проверки пригодности;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% высокомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 110000 до 135000 Да в случае СО декстрана 40 для проверки пригодности; от 190000 до 230000 Да в случае СО декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 180000 до 240000 Да в случае СО декстрана 70 для проверки пригодности;

- полученное значение среднемассовой молекулярной массы 10% низкомолекулярной фракции декстрана для проверки пригодности системы лежит в пределах от 6000 до 9000 Да в случае СО декстрана 40 для проверки пригодности; от 7000 до 11000 Да в случае СО декстрана 60/70 для проверки пригодности и от 7000 до 11000 Да в случае СО декстрана 70 для проверки пригодности;

Молекулярно-массовое распределение испытуемого декстрана Хроматографируют испытуемый раствор, определяют значение среднемассовой молекулярной массы (Mw) по уравнениям (2) и (3) и значения  для 10% высокомолекулярной и 10% низкомолекулярной фракций декстрана по уравнениям (4)-(6) и (7)-(9) соответственно.