-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 31.10.2018 № 749 |
Дата введения в действие: | c 01.12.2018 |
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания |
Раздел: | 1.2.1.2. Хроматографические методы анализа |
Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
Номер: | ОФС.1.2.1.2.0007.18 |
Внутр.№: | 1394.1 |
Статус: | Действующая статья |
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод эксклюзионной хроматографии, являющийся разновидностью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) по механизму разделения, предназначенный для определения молекулярных параметров различных веществ в широком диапазоне молекулярных масс - от до Да. Принцип метода эксклюзионной хроматографии изложен в ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография".
В отличие от адсорбционной хроматографии, в эксклюзионной хроматографии стационарная фаза остается химически инертной и с разделяемыми веществами не взаимодействует. В зависимости от природы подвижной фазы эксклюзионная хроматография подразделяется на две разновидности. При использовании органической подвижной фазы метод называют гель - проникающей хроматографией, при использовании водной подвижной фазы - гель - фильтрационной хроматографией.
Методом эксклюзионной хроматографии представляется возможным разделение молекул различных веществ по их размерам в широком диапазоне молекулярных масс, что делает его незаменимым для исследования лекарственных средств, представляющих собой синтетические или биологические полимеры.
Диапазон размеров разделяемых молекул определяется диапазоном размеров пор стационарной фазы. Высокомолекулярные вещества, размер которых превышает максимальный размер пор материала колонки, мигрируют с большей скоростью между частицами неподвижной фазы, не задерживаясь и элюируются в свободном объеме колонки ( - объем колонки за вычетом объема стационарной фазы, соответствует объему удерживания компонентов, размер молекул которых больше, чем наибольшие поры сорбента). Молекулы с наименьшей молекулярной массой свободно проходят в поры сорбента вместе с молекулами растворителя, задерживаясь в них, и элюируются последними. Их объем удерживания близок к общему объему колонки (, или общий объём подвижной фазы, соответствующий объему удерживания компонентов, размер молекул которых меньше, чем наименьшие поры сорбента). Распределение молекул по размерам и молекулярной массе происходит в диапазоне между свободным объемом () и общим объемом колонки (), представляющим собой диапазон эксклюзии колонки. Наиболее эффективное распределение происходит в первые две трети данного диапазона.
Метод эксклюзионной хроматографии используется в качественном и количественном анализе лекарственных средств в различных испытаниях, указанных в ОФС "Высокоэффективной жидкостной хроматографии".
Определение относительного компонентного состава смесей.
Эксклюзионная хроматография применяется для разделения смесей, компоненты которых достаточно различаются по молекулярной массе, например, в лекарственных средствах белковой природы.
Разделение проводят по методике, указанной в фармакопейной статье и нормативной документации. Регистрируют хроматограмму и измеряют площади соответствующих пиков. Относительное содержание каждого компонента рассчитывают как отношение площади пика искомого компонента к сумме площадей пиков всех компонентов смеси. Если для разных компонентов исследуемого образца чувствительность по регистрируемому параметру различается, то для расчета содержания компонентов применяют метод внешнего стандарта с использованием соответствующих стандартных веществ, указанных в фармакопейной статье и нормативной документации.
Определение молекулярных масс соединений и молекулярно-массового распределения полимеров.
Эксклюзионная хроматография может быть использована для определения молекулярной массы вещества и ее распределения путем сравнения с соответствующими стандартными веществами для калибровки, указанными в фармакопейной статье и нормативной документации. По стандартным образцам с известными значениями молекулярной массы строят калибровочную кривую зависимости объема или времени удерживания от логарифма молекулярных масс. По калибровочной кривой рассчитывают молекулярную массу испытуемого образца. Если диапазон молекулярных масс стандартных образцов укладывается в диапазон эксклюзии колонки, калибровочная кривая приближается к прямой линии для данной колонки.
Следует учитывать, что времена удерживания или объемы элюирования анализируемых полимеров не характеризуются прямой связью с молекулярной массой исследуемого вещества и зависят от условий измерений (типа полимера, колонок, подвижной фазы и т.д.) Фактически разделение обеспечивается за счет разного гидродинамического объема молекул образца, т.е. разного размера молекул, имеющего определенную связь с массой. Поэтому для корректного определения молекулярной массы и оценки молекулярно-массового распределения необходима точная калибровка хроматографической системы, выполненная в условиях анализа исследуемого образца. При этом природа стандартных образцов по возможности должна быть аналогичной природе испытуемого вещества.
Оборудование для эксклюзионной хроматографии принципиально не отличается от используемого в других видах высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография"). Основное отличие заключается в применении хроматографических колонок, заполненных специальными сорбентами.
Из всех видов жидкостной хроматографии в эксклюзионной хроматографии наиболее жесткие требования предъявляются к стабильности потока подвижной фазы. Поэтому при эксклюзионной хроматографии необходимо использовать насосные системы с точностью подачи подвижной фазы не хуже 0,3-0,5%. Разделение в эксклюзионной хроматографии всегда изократическое.
Точность результатов в эксклюзионной хроматографии значительно зависит от температуры, поэтому, как правило, требуется термостатирование разделительной системы.
Современные сорбенты для эксклюзионной хроматографии представляют собой полужесткие или жесткие гели или пористые частицы на основе поперечно-сшитой агарозы, декстрана, полимеров, таких как полиметакрилат или стирол-дивинилбензол, гидроксилированного силикагеля. Главной характеристикой таких сорбентов являются размеры пор, определяющие диапазон молекулярных масс, которые можно разделить на данном сорбенте. Если анализируемая смесь содержит вещества, отличающиеся по молекулярной массе не более чем на 2-2,5 порядка, ее обычно удается разделить на хроматографической колонке с одним набором пор. При более широком диапазоне молекулярных масс следует использовать единовременно несколько колонок с сорбентами различной пористости.
В эксклюзионной хроматографии используются следующие детекторы: рефрактометрический, спектрофотометрический, флуориметрический. Специально для анализа полимеров разработаны вискозиметрический детектор и детектор многоуглового лазерного светорассеяния. Эти детекторы в комбинации с рефрактометром или другим концентрационным детектором позволяют непрерывно определять молекулярную массу полимера в элюате.
Подвижную фазу выбирают исходя из свойств испытуемого образца, типа сорбента колонки и метода.
Подвижные фазы для анализа водорастворимых соединений обычно представляют собой растворы неорганических солей таких как хлорид, нитрат или сульфат натрия иногда с добавкой антимикробного агента (например, азида натрия). Наличие соли в подвижной фазе необходимо для предотвращения нежелательных сорбционных эффектов.
Критерии оценки пригодности хроматографической системы, а также при необходимости допустимая степень изменения ее параметров указаны в ОФС "Хроматография". При определении молекулярной массы и молекулярно-массового распределения полимеров требуются дополнительные критерии, связанные с оценкой пригодности калибровочной кривой, которые должны быть указаны в фармакопейной статье и нормативной документации.