Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод аффинной хроматографии.

Афинная хроматография является разновидностью метода хроматографии по механизму разделения, основанному на высокоспецифичном взаимодействии между веществом.

Область применения

Данный метод в основном предназначен для разделения и определения и очистки белков, пептидов, антител, полисахаридов и др. в зависимости от лиганда, используемого в анализе.

Основы метода

В основе аффинной хроматографии лежит взаимодействие определяемого вещества из смеси с лигандом, связанным с инертным носителем, образующими неподвижную фазу. Главной особенностью аффинной хроматографии является высокая специфичность лиганда, иммобилизованного на носителе, к определяемому веществу, или так называемая аффинность. Специфичность реакции обычно обусловлена взаимодействием фермент-субстрат, антиген-антитело или гормон-рецептор. Однако, возможно использование аффинной хроматографии и для других типов высокоспецифического взаимодействия, например, фермент-кофактор, фермент-ингибитор, пептиды-специфические антитела и др.

Существует несколько разновидностей метода аффинной хроматографии таких, например, как колоночная аффинная хроматография, мембранная аффинная хроматография и др.

Колночная афинная хроматография обычно идет в 2 этапа: 1) сорбция определяемого вещества или группы веществ на колонки путем их реакции с иммобилизованным на носителе лигандом; 2) промежуточная промывка колонки для удаления не специфически связанных компонентов; 3) десорбция исследуемого компонента смеси с колонки. Для первого этапа подбирают такие условия (состав буферного раствора, pH, ионная сила буферного раствора, температура и т.д.), которые являются наиболее благоприятными для взаимодействия аффинной пары. После этого колонку хорошо промывают и проводят десорбцию определяемого вещества. Это обычно достигается с помощью повышения ионной силы буферного раствора, повышением или понижением его pH или добавлением различных органических растворителей или введением в буферный раствор различных хаотропных агентов. Также можно проводить десорбцию раствором конкурирующего лиганда. Иногда для лучшей десорбции и получения более качественной хроматограммы используют линейный градиент (pH, ионной силы или содержания органического растворителя).

В мембранной аффинной хроматографии вместо колонки с сорбентом используется фильтрационный элемент, с иммобилизованном на нем специфическом лиганде. Мембранная аффинная хроматография в целом состоит из тех же этапов, однако специфика мембранного метода позволяет уменьшить объем сорбента, благодаря эффективности сорбента в виде мембраны. Кроме того, в мембранном варианте резко возрастает скорость очистки при близкой к колоночной эффективности. Благодаря меньшим объемам использования буферного раствора и непосредственно самого сорбента, процесс легче масштабировать.

Тонкослойная аффинная хроматографя представляет собой классический вариант тонкослойной хроматографии, где на пластинку иммобилизован специфический лиганд.

Однако чаще всего в фармакопейном анализе используется колоночный вариант аффинной хроматографии.

Оборудование

Для колоночной аффинной хроматографии используется стандартное оборудование для колоночной хроматографии. Набор необходимых узлов системы обычно включает в себя хроматографическую колонку, насос, систему ввода пробы, систему детектирования, систему сбора и обработки данных. Возможно использование коллектора фракций и градиентного смесителя.

Неподвижная фаза

Неподвижная фаза аффинной хроматографии представляет собой специально синтезированный сорбент, состоящий из инертного носителя, соединенного со специфическим лигандом (возможно использование "спейсера" для сшивки). В качестве инертного носителя часто используют сефарозу (агарозу, имеющую дополнительные поперечные сшивки), например сефароза 4В или сефароза CL, однако при необходимости возможно использование и других носителей, в том числе неорганических. Содержание лиганда обычно не превышает 5-15 мкмоль на 1 г носителя. Однако его должно быть достаточно, чтобы хроматография имела приемлемый выход. Лиганд и его связь с матрицей должны быть достаточно стабильны в установленных хроматографических условиях (температура, pH, ионная сила и т.д.). В качестве лиганда может выступать практически любое соединение, имеющие специфичность к определяемому веществу. Это может быть субстрат или ингибитор фермента, рецептор, специфичный к определяемому гормону, антитела или др. Кроме того, лиганды могут быть также группоспецифические, то есть обладающие специфичностью сразу к целой группе родственных веществ, например, к какой-либо группе ферментов.

Подвижная фаза

Подвижная фаза аффинной хроматографии представляет собой жидкий элюент, инертный по отношению к другим компонентам хроматографии (неподвижная фаза, опредляемое вещество). Подвижная фаза должна обладать низкой вязкостью и быть совместимой с используемыми методами детектирования. В качестве подвижной фазы обычно буферные водные растворы с различными pH, состав элюента подбирается в зависимости от условий хроматографирования. Чаще всего, из-за сильного удерживания компонентов смеси сорбентом, необходимо использование ступенчатого или линейного градиентного элюирования.

Методика

Методика проведения колоночной аффинной хроматографии аналогична методике любой стандартной колоночной хроматографии. Прежде всего, подготавливается хроматографическая колонка. Для этого осуществляется правильная "набивка" колонки сорбентом. Для плотного и равномерного заполнения колонки возможно использование суспензионного метода. После этого колонка обязательного уравновешивается. Затем в колонку под давлением подается элюент. Проба может вводиться как фронтальным методом, так и через специальный дозирующий кран с известным объемом петли. На выходе из колонки раствор элюента с разделенными определяемыми компонентами проходит через детектор. В качестве детектора возможно использование любой детектирующей системы для колоночной жидкостной хроматографии (см. ОФС "Хроматография", ОФС "Высокоэффективная жидкостная хроматография"). Возможно проведение постколоночной дериватизации для увеличения чувствительности детектирования. Для регистрации результатов хроматографии и получения хроматограммы возможно использование самописца, однако предпочтительнее использование компьтюерного сбора и обработки данных. Это повышает точность анализа и позволяет сразу провести анализ хроматограммы с помощью специальных программ, подсчитывающих в автоматическом режиме параметры хроматограммы (например, площадь пиков). Для сбора проб возможно использование коллектора фракций, подключенного к системе сбора данных.

Перечень условий хроматографирования, подлежащих указанию

В фармакопейной статье должны быть приведены: параметры колонки (длина и внутренний диаметр) и температура колонки (если необходимо термостатирование) для колоночной аффинной хроматографии, параметры мембраны (площадь, количество слоев) для мембранной аффинной хроматографии или параметры пластинки для афинной ТСХ (в соответствии с ОФС "Тонкослойная хроматография"); тип сорбента с указанием иммобилизованного лиганда; объем вводимой пробы (объем петли); состав подвижной фазы и способ ее приготовления; скорость подачи подвижной фазы; тип детектора и условия детектирования (при необходимости параметры используемой ячейки детектора); описание градиентного режима (если используется), включающее в себя стадию переуравновешивания к исходным условиям, время хроматографирования, описания приготовления стандартных и испытуемых растворов.

Испытание на чистоту и допустимые пределы примесей

Определение примесей в лекарственных средствах и оценку их содержания проводят с помощью:

- визуального сравнения с эталонными растворами, устанавливающими предел содержания данной примеси, после проведения реакции c испытуемым и эталонным растворами. Окраска или опалесценция/помутнение испытуемого раствора должна быть не интенсивнее окраски или опалесценции/помутнения эталонного раствора;

- физико-химических методов (спектроскопические, хроматографические и другие методы).

Общие замечания

1. Вода и все реактивы должны быть свободны от ионов, на содержание которых проводят испытания.

2. Пробирки, в которых проводят наблюдения, должны быть бесцветными, прозрачными, из нейтрального стекла с плоским дном, одинакового диаметра (около 1,5 см, если не указано иначе).

3. Если не указано иначе, навески для приготовления эталонных растворов отвешивают с точностью до 0,001 г.

4. Наблюдения помутнения и опалесценции растворов проводят в проходящем свете на темном фоне, а окраски - по оси пробирок при дневном отраженном свете на матово-белом фоне.

5. Прибавление реактивов к испытуемому и эталонному растворам проводят одновременно и в одинаковых количествах.

6. В случае, когда в соответствующей фармакопейной статье или нормативной документации указано, что в данной концентрации раствора не должно обнаруживаться той или иной примеси, поступают следующим образом. К 10 мл испытуемого раствора прибавляют применяемые для каждой реакции реактивы, указанные в методике, кроме основного реактива, открывающего данную примесь. Затем раствор делят на две равные части: к одной из них прибавляют основной реактив и оба раствора сравнивают между собой. Между ними не должно быть заметной разницы.