Спектроскопия кругового дихроизма

ОФС.1.2.1.1.0013.18   Вводится впервые

 

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод спектроскопии кругового дихроизма (КД-спектроскопия), основанного на анизотропии оптически активных молекул, при пропускании света, поляризованного по правому или левому кругу.

 

Область применения

 

КД-спектроскопия используется в основном для изучения структуры органических молекул, обладающих оптической изомерией. С помощью данного метода можно дифференцировать вклады полос поглощения различных изомеров в суммарную оптическую активность исследуемого образца. Этот метод может использоваться для анализа смесей оптических изомеров биологически активных веществ, для контроля качества лекарственных средств. Кроме того, КД-спектроскопия является популярным методом определения количества белка и контроля за его вторичной структурой в растворах (то есть за денатурационными изменениями).

 

Суть метода

 

При прохождении через любую оптически активную среду плоскополяризованного света, он становится эллиптически поляризованным. Данное явление связано с различными величинами поглощения средой двух волн, составляющих этого света, с противоположной круговой поляризацией. Разность этих величин поглощения называют круговым дихроизмом. Полученные в ходе эксперимента спектры кругового дихроизма сравнивают со стандартными спектрами КД. Благодаря этому получают качественный и количественный состав исследуемого образца. Метод КД обладает высокой чувствительностью (вплоть до анализа десятков микрограммов субстанции).

 

Методика

 

Из образцов готовят растворы одинаковой концентрации. Концентрацию подбирают таким образом, чтобы при максимуме поглощения исследуемого вещества оптическая плотность составляла примерно 1.

Растворы помещают в кварцевую кювету и проводят измерение КД на соответствующем приборе в указанном диапазон длин волн. Далее проводят анализ полученных спектров, сравнивая их с реперными спектрами и проверяя наличие эффекта Коттона в области поглощения хромофора. Наличие или отсутствие данного эффекта может определить обладает ли образец оптической активностью.

Непосредственное измерение оптической плотности дает следующее выражение:

 

,

 

где  - оптическая плотность кругового дихроизма;

 - оптическая плотность для света с левой круговой поляризацией;

 - оптическая плотность для света с правой круговой поляризацией.

 

Величину кругового дихроизма рассчитывают по следующей формуле:

 

,

 

где  - молярный круговой дихроизм или молярный дифференциальный дихроичный коэффициент поглощения, ;

 - молярный коэффициент поглощения для света с левой круговой поляризацией;

 - молярный коэффициент поглощения для света с правой круговой поляризацией;

с - концентрация вещества в исследуемом растворе, ;

l - длина оптического пути, см.

 

Кроме того, для характеристики кругового дихроизма также используют следующие единицы

Коэффициент асимметрии:

 

,

 

Где  - молярный коэффициент поглощения.

 

Молярная эллиптичность:

Некоторые типы приборов непосредственно показывают величину молярной эллиптичности , выраженную в градусах. При использовании таких приборов молярная эллиптичность может быть рассчитана по следующему уравнению:

 

,

 

 - молярная величина эллиптичности, выраженная в ;

 - величина эллиптичности, показываемая прибором;

M - относительная молекулярная масса исследуемого вещества;

с - концентрация исследуемого вещества в растворе, г/мл;

l - длина оптического пути, см.

 

Молярная эллиптичность также связана с молярным круговым дихроизмом уравнением:

 

 

Молярная эллиптичность часто используется в анализе белков и нуклеиновых кислот. В этом случае молярная концентрация, выраженная в единицах мономерных остатков, рассчитывается исходя и отношения молекулярной массы к числу аминокислот.

Для белков среднее значение относительной молекулярной массы мономерного остатка составляет от 100 до 120, для нуклеиновых кислот (в виде натриевой соли) - около 330.

 

 

Рис. 1 Спектр кругового дихроизма на примере раствора альбумина.

 

Прибор

 

Основные составляющие КД-спектрометра или, по-другому, дихрографа:

- источник излучения (обычно ксеноновая лампа);

- система круговой поляризации света (двойной монохроматор, кварцевые призмы, двоякопреломляющий модулятор);

- детектор (фотоумножитель);

- усилитель сигнала.

Дихрограф способен производить измерения в диапазоне длин волн от 170 до 800 нм.

 

Калибровка

 

Для проверки правильности шкалы оптической плотности обычно используют раствор изоандростерона в диоксане (10 мг изоандростерона растворяют в 10,0 мл диоксана).Снимают КД-спектр в диапазоне от 280 нм до 360 нм. Величина Ае, измеренная при 304 нм, должна быть равна +3,3. Линейность модуляции проверяют обычно с помощью раствора (1 S)-(+)-10- камфорсульфоновой кислоты в воде (10,0 мг кислоты в 10,0 мл воды). Сначала спектрофотометрически определяют точную концентрацию камфорсульфоновой кислоты, используя удельный показатель поглощения при 285 нм, равный 1,49. Далее снимают КД-спектр в диапазоне от 185 нм до 340 нм. Величина Де, измеренная при 290,5 нм, должна быть равна от +2,2 до +2,5, а измеренная при 192,5 нм - от -4,3 до -5. Также возможно использование (Ж)-(+)-аммония 10-камфорсульфоната.