Настоящая фармакопейная статья распространяется на лекарственное средство пирогенал, суппозитории ректальные, которое представляет собой липополисахарид (ЛПС), выделенный из клеток Salmonella typhi

Производство

Технология получения ЛПС предусматривает культивирование производственного штамма (штамма-продуцента) в полусинтетической питательной среде, инактивацию микробных клеток формалином, поэтапное выделение и очистку ЛПС ферментативными методами.

Производственный штамм Salmonella typhi Ту2 4446 должен обладать типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами:

- на плотной питательной среде (мясопептонный агар) должен образовывать круглые, гладкие, выпуклые, блестящие колонии (S-форма);

- на висмут-сульфитном агаре должен образовывать блестящие колонии черного цвета;

- в мазках, окрашенных по Граму, должны присутствовать грамотрицательные палочки с закругленными концами;

- должен ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу с образованием кислоты без газа;

- должен продуцировать сероводород;

- не должен ферментировать лактозу и сахарозу;

- не должен образовывать индол;

- LD₅₀ штамма при внутрибрюшинном заражении белых беспородных мышей должна быть не более 5·10⁷ микробных клеток.

Основные этапы производства препарата

1) Получение биомассы и ее инактивация;

2) Концентрирование методом сепарирования;

3) Поэтапное выделение и очистка ЛПС ферментативными методами;

4) Получение готовой лекарственной формы препарата.

На этапе культивирования используют полусинтетическую питательную среду. Полученную биомассу проверяют на микробиологическую чистоту и типичность морфологии; проводят контроль биохимических свойств микроорганизмов; антигенные свойства проверяют в реакции агглютинации. Инактивацию микробных клеток проводят формалином, по окончании процесса инактивированную биомассу высевают на дифференциально-диагностическую питательную среду висмут-сульфитный агар для подтверждения отсутствия роста сальмонелл.

Инактивированную культуральную жидкость подвергают ферментативному гидролизу и сепарированию; из гидролизата ферментативными методами поэтапно выделяют ЛПС, а затем лиофилизируют, получая субстанцию-лиофилизат очищенного ЛПС. На стадии производства субстанцию испытывают по следующим показателям:

Описание. Порошок светло-кремового цвета. Определение проводят визуально.

Белок. Не более 3%. Испытания проводят колориметрическим методом по методу Лоури в соответствии с ОФС "Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах". Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Нуклеиновые кислоты. Не более 5%. Испытания проводят методом Спирина в соответствии с ОФС "Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина в иммунобиологических лекарственных препаратах". Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Углеводы. От 40 до 60%. Испытания проводят с антроновым реактивом в соответствии с ОФС "Определение сахаров спектрофотометрическим методом". Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Безвредность. Препарат должен быть безвредным. Испытания проводят на 5 здоровых белых мышах массой  г, которым внутрибрюшинно вводят 1 мл раствора ЛПС с концентрацией 100 мкг/мл; срок наблюдения за животными составляет 5 дней. Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Оптическая плотность. Показания оптической плотности раствора липополисахарида при 256 нм не должны превышать 0,300; при 280 нм - не более 0,200. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимых областях". Приготовление испытуемого образца ЛПС указывается в нормативной документации.

Потеря массы при высушивании. Не более 10%. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Определение минимальной пирогенной дозы (МПД) рабочей серии ЛПС. Одна МПД должна составлять  мкг ЛПС. Предварительно готовят раствор ЛПС в концентрации 100 мкг/мл, затем путем последовательных десятикратных разведений получают раствор с концентрацией 0,01 мкг/мл и из него - раствор с концентрацией 0,0075 мкг/мл (к 9 мл испытуемого образца с концентрацией 0,01 мкг/мл прибавляют 3 мл 0,9% раствора натрия хлорида). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". За 1 ч до опыта у каждого кролика дважды с интервалом не менее 30 мин измеряют ректальную температуру. Различия в показаниях температуры у одного и того же животного не должны превышать 0,2°С. Животным вводят раствор препарата с концентрацией 0,0075 мкг/мл внутривенно из расчета 1 мл на 1 кг массы тела. Средний показатель повышения температуры должен составлять от 0,6 до 0,8°С.

В случае, если средний показатель повышения температуры будет ниже 0,6°С, вводят раствор препарата с концентрацией 0,01 мкг/мл по 1 мл на 1 кг массы животного; если средний показатель повышения температуры будет выше 0,8°С, вводят раствор препарата с концентрацией 0,005 мкг/мл по 1 мл на 1 кг массы животного. Повторный контроль проводят на том же количестве кроликов. Если при повторном испытании после введения растворов с концентрацией 0,01 или 0,005 мкг/мл средний показатель повышения температуры у животных составит ниже 0,6°С или выше 0,8°С соответственно, препарат бракуют. Минимальное количество вещества, вводимого внутривенно, на 1 кг массы кролика, вызывающее среднее повышение температуры тела на 0,6-0,8°С составляет МПД. Одна МПД должна составлять  мкг ЛПС.

Субстанцию - лиофилизат очищенного ЛПС используют для получения лекарственного препарата пирогенал, суппозитории ректальные.

Испытания

Описание. Суппозитории желтовато-белого цвета однородной консистенции, цилиндрической формы с заостренным концом, диаметром не более 10 мм.

Подлинность. Должен быть пирогенным. Одна МПД должна составлять  мкг ЛПС (раздел "Специфическая активность").

Средняя масса и отклонение от средней массы. . Определение проводят в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

Температура и время плавления. Не более 20 мин. Один суппозиторий, залитый 50 мл воды очищенной, подогретой до температуры , помещенный в конической колбе вместимостью 100 мл в термостат при температуре , должен расплавиться в течение не более 20 мин.

Микробиологическая чистота. В 1 суппозитории допускается не более 300 колониеобразующих единиц (КОЕ) микробов-сапрофитов при отсутствии патогенных, условно-патогенных микроорганизмов и грибов. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота".

Безвредность. Должен быть безвредным. Для испытания отбирают 4 суппозитория. Испытуемые образцы помещают в пробирку вместимостью 20 мл и расплавляют на водяной бане при температуре 40-45°С в течение 15-20 мин. Расплавленную массу вводят 5 беспородным белым мышам массой  г по 1 мл внутрибрюшинно со скоростью 0,1 мл/с шприцем вместимостью 1 см³. В течение 5 сут животные должны оставаться живыми. В случае гибели хотя бы 1 животного опыт повторяют на удвоенном количестве мышей. Если при повторном испытании мыши остались живы, препарат считают прошедшим испытание. В противном случае препарат бракуют.

Специфическая активность. Должен быть пирогенным. При введении 1 МГТД на 1 кг массы кролика средний показатель повышения температуры должен составлять 0,6-0,8°С. Для определения специфической активности берут 3 суппозитория. В коническую колбу вместимостью 500 мл наливают 295 мл 0,9% раствора натрия хлорида и доводят его до закипания. В раствор опускают 3 суппозитория и ставят колбу на разогретую магнитную мешалку. Экстракцию пирогенала из суппозиториев проводят в течение 60 мин при интенсивном перемешивании, чтобы жировой слой разбивался на мельчайшие капельки, затем содержимое отстаивают в течение 10-15 мин. В результате полученный раствор пирогенала считают разведенным в 100 раз, т.е. до 0,5; 1; 1,5; 2 мкг/мл в зависимости от исходного содержания пирогенала в 1 суппозитории. Далее из нижнего слоя раствора делают разведение до 0,0075 мкг/мл. Трем кроликам вводят препарат в концентрации 0,0075 мкг/мл внутривенно из расчета 1 мл на 1 кг массы. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Средний показатель повышения температуры должен составлять 0,6-0,8°С. Если повышение температуры будет ниже 0,6°С или выше 0,8°С, то испытуемый образец вводят повторно в концентрации 0,01 или 0,005 мкг/мл. Если при этом средний показатель повышения температуры будет ниже 0,6°С или выше 0,8°С, серию бракуют.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С.