Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади	ФС.3.3.1.0038.15
	Взамен ФС 42-412ВС-99

Настоящая фармакопейная статья распространяется на иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади, который представляет собой белковую гамма-глобулиновую фракцию сыворотки крови лошади, обладающую активностью в отношении вируса бешенства. Препарат в комбинации с вакциной антирабической предназначен для профилактики бешенства по экстренным показаниям.

 

Производство

 

Производство иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади должно осуществляться с соблюдением установленных требований правил организации производства и контроля качества лекарственного препарата, гарантирующих сохранение структуры и функции белков иммуноглобулина, обеспечивающих специфическую и вирусную безопасность препарата и исключающих контаминацию чужеродными агентами.

Иммуноглобулин из сыворотки крови лошади, раствор для инъекций, получают из плазмы крови лошадей, гипериммунизированных вирусом бешенства. Для иммунизации животных-продуцентов используют производственный штамм фиксированного вируса бешенства "Москва". Для получения очищенной концентрированной гамма-глобулиновой фракции плазмы лошади, содержащей противовирусные антитела, нейтрализующие вирус бешенства, применяют риванол-спиртовой метод.

Иммуноглобулин антирабический из сыворотки крови лошади выпускают в комплекте с иммуноглобулином антирабическим разведенным 1:100, предназначенным для проведения внутрикожной пробы с целью выявления гиперчувствительности к белкам сыворотки крови лошади.

 

Производственный штамм вируса бешенства

 

Производственный штамм фиксированного вируса бешенства "Москва" должен соответствовать следующим требованиям:

Подлинность. Должен нейтрализоваться иммуноглобулином антирабическим из сыворотки крови лошади и не должен нейтрализоваться нормальной сывороткой крови крупного рогатого скота. Индекс нейтрализации должен быть не менее 100.

Для испытания параллельно готовят 2 ряда 10-кратных разведений вируса в диапазоне 1:5 до 1:50000. В качестве среды разведения используют 2% раствор нормальной лошадиной сыворотки, приготовленный с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций. Сыворотку лошадиную нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для получения разведений в первую пробирку каждого ряда, соответствующую разведению 1:5, вносят 0,4 мл среды разведения, в остальные пробирки ряда - по 0,45 мл среды разведения. В первую пробирку каждого ряда добавляют по 0,1 мл восстановленной суспензии вируса бешенства штамм "Москва" и тщательно перемешивают содержимое пробирок. Далее готовят ряд последовательных разведений путем переноса 0,05 мл смеси из пробирки с готовым разведением в следующую в ряду пробирку, каждый раз используя новую пипетку (или наконечник автоматической пипетки). Из последней пробирки, соответствующей разведению 1:50000, удаляют 0,05 мл смеси в емкость с дезинфицирующим раствором. В результате конечный объем содержимого каждой пробирки составляет 0,45 мл смеси.

После приготовления разведений вируса в каждую пробирку первого ряда вносят по 0,45 мл иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади; в каждую пробирку второго ряда добавляют по 0,45 мл нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота, инактивированной при температуре 56°С в течение 30 мин.

В результате получают 2 ряда разведений вируса бешенства штамм "Москва" от 10^-1 до 10^-5 в комбинации со специфическими противовирусными антителами (первый ряд) или в смеси с нормальными антителами, не способными нейтрализовать вирус (второй ряд). Содержимое пробирок осторожно перемешивают путем встряхивания и инкубируют при температуре  в течение  мин. Затем пробирки охлаждают на льду до комнатной температуры и по 0,03 мл содержимого каждой пробирки вводят интрацеребрально 6 беспородным мышам массой 9-10 г. За животными наблюдают 14 дней. Мышей, погибших в течение первых 4 дней, при расчетах не учитывают. Титр вируса, использованного для заражения каждой из 2 групп мышей, вычисляют по методу Рида и Менча. Индекс нейтрализации рассчитывают путем вычитания логарифма обратного разведения, соответствующего LD₅₀ вируса в смеси с иммуноглобулином антирабическим лошадиным, из логарифма обратного разведения, соответствующего LD₅₀ вируса в смеси с нормальной сывороткой крупного рогатого скота. Если полученная разница превышает 2, то индекс нейтрализации больше 100.

Стерильность. Не должен содержать бактерий, в том числе микобактерий туберкулеза и грибов.

Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят в соответствии с ОФС "Стерильность". Испытание на отсутствие микобактерий туберкулеза проводят путем посева на среду Левенштейна-Йенсена.

Присутствие микоплазм. Не должен содержать микоплазм. Испытание проводят микробиологическим методом в соответствии с ОФС "Испытание на присутствие микоплазм".

Посторонние вирусные агенты. Не должен содержать посторонних вирусных агентов по результатам испытания на мышах-сосунках, беспородных белых мышах массой 15-20 г, морских свинках массой 350-500 г, культурах клеток.

Инфекционный титр вируса. Не менее 10^-6 LD₅₀/мл при интрацеребральном заражении беспородных белых мышей массой 9-10 г и не более 10^-1,5 LD₅₀/мл при внутримышечном и подкожном путях заражения; не менее 10^-5,0 LD₅₀/0,2 мл при итрацеребральном заражении кроликов породы Шиншилла массой 2,5-3 кг.

При необходимости проведения пассажа исходного производственного штамма для приготовления антигена для гипериммунизации животных-продуцентов допускается проведение не более 3 пассажей через мозг кролика.

 

Животные-продуценты

 

Для иммунизации используют клинически здоровых лошадей без различия пола. При отборе животных-продуцентов не допускается использовать лошадей, прошедших ранее курс гипериммунизации против любых вирусных инфекций. Для производства иммуноглобулина используют сыворотки лошадей с титром не ниже 1:500, определенных в реакции нейтрализации на белых мышах с разрешающей дозой вируса 100-500 LD₅₀/0,03 мл.

 

Выделение балластных белков и получение осадка гамма-глобулина

 

Выделение балластных белков и получение осадка гамма-глобулина с целью его очистки и концентрирования проводят риванол-спиртовым методом.

 

Вспомогательные вещества

 

В состав препарата могут входить вспомогательные компоненты, разрешенные к медицинскому применению в дозах, не вызывающих токсические, аллергические или иные нежелательные реакции у человека. В качестве стабилизатора используют глицин.

 

Испытания промежуточных продуктов на производстве

 

Сыворотка, полученная от гипериммунизированных .животных, должна иметь рН от 7,5 до 7,7. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Надосадочная жидкость после этапа выделения балластных белков проверяется на полноту осаждения риванола: риванол должен отсутствовать. Определение проводят методом флуоресценции.

Фильтрат для выделения гамма-глобулина - рН от 6,8 до 7,2.

Определение проводят потенциометрически в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Жидкий иммуноглобулин испытывают на содержание белка (должно содержаться от 9 до 11%). Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Определение белка".

Этап розлива и запайки ампул. По показателю "Герметичность" испытывают все ампулы серии. Для проведения испытания ампулы помешают в кассеты, заполненные водой, подкрашенной любым красителем, растворимым в воде. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы полностью находились в воде. Емкость с установленными в ней кассетами с испытуемыми ампулами герметично закрывают и создают в ней избыточное, по сравнению с атмосферным, давление  кПа. Давление выдерживают в течение 20-25 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. Емкость открывают, кассеты с ампулами вынимают и просматривают на наличие в них подкрашенной воды. Ампулы, содержащие подкрашенную воду, считают не выдержавшими испытание.

 

Испытания

 

Описание. Прозрачная или слабо опалесцирующая жидкость от бесцветной до слабо-желтой окраски. Не допускается розовое окрашивание. Определяют визуально.

Подлинность. При испытании определяют следующие параметры подлинности препарата:

1. Видоспецифичность. Должен обладать видовой специфичностью, свойственной только белкам сыворотки крови лошади. Определение проводят методом кольцепреципитации с использованием коммерческих сывороток, преципитирующих белки сыворотки крови лошади, человека, крупного рогатого скота и свиньи.

Испытуемый образец разводят 0,9% раствором натрия хлорида в соотношении 1:1000. В 4 стеклянные преципитационные пробирки высотой 6-10 мм вносят по 0,4 мл разведенного образца, затем на дно пробирок путем подслаивания под образец медленно вносят по 0,1 мл преципитирующей сыворотки: в первую пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови лошади, во вторую пробирку - преципитирующую сыворотку к белкам сыворотки крови человека, в третью пробирку - сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови крупного рогатого скота, в четвертую пробирку сыворотку, преципитирующую белки сыворотки крови свиньи. Учет результатов проводят визуально при дневном освещении на черном фоне при температуре  немедленно после выполнения реакции и по истечении 1 ч. Образец считают выдержавшим испытание, если в первой пробирке (с гомологичной сывороткой) образуется кольцо преципитации в течение 1-10 мин, и если во второй, третьей, четвертой пробирках (с гетерологичными сыворотками) не образуется кольцо преципитации в течение 1 ч.

2. Специфичность антител. Должен содержать антитела к вирусу бешенства. Определение проводят в соответствии с разделом "Специфическая активность".

Прозрачность. Прозрачный или слегка опалесцируюший раствор с оптической плотностью не более 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях" в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм по сравнению с водой очищенной. Метод определения указывают в нормативной документации.

Цветность. Бесцветный или светло-желтый раствор с оптической плотностью не более 0,15. Определение проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях" в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм по сравнению с водой очищенной. Метод определения указывают в нормативной документации.

рН. От 6,6 до 7,4. Испытуемый образен разводят до 1% концентрации 0,9% раствором натрия хлорида. Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

Белок. От 9 до 11%. Определение проводят колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Определение белка".

Электрофоретическая однородность. Содержание фракции  должно быть не менее 80%; фракций ,  - не более 20%; альбумины должны отсутствовать. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение однородности сывороточных препаратов методом электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы".

Риванол. Должен отсутствовать. Должна отсутствовать характерная для риванола желто-зеленая флуоресценция.

Препарат визуально сравнивают со стандартным раствором, содержащим 0,2 мкг/мл риванола. Для испытания в одну кварцевую кювету толщиной слоя 10 мм вносят препарат иммуноглобулина, в другую - стандартный раствор риванола, проводят измерение в ультрафиолетовом свете.

Примечания.

1. Приготовление основного раствора риванола 100 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 мг риванола, растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранению не подлежит.

2. Приготовление стандартного раствора риванола 0,2 мкг/мл. Перед определением основной раствор риванола разводят в 50 раз водой очищенной (до концентрации 2 мкг/мл). К 0,5 мл полученного раствора добавляют 4,5 мл воды очищенной и перемешивают. Используют свежеприготовленный раствор.

 

Спирт этиловый. Не более 4,5%. Определение проводят методом, указанным в нормативной документации, в соответствии с требованиями ОФС "Определение спирта этилового в жидких фармацевтических препаратах".

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС "Стерильность".

Пирогенность. Должен быть апирогенным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Препарат вводят из расчета 1 мл на 1 кг массы тела кролика.

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность".

Препарат вводят по 1 мл внутрибрюшинно 5 белым мышам массой 17-20 г, подкожно 2 морским свинкам массой 250-300 г - по 2,5 мл в каждый бок (если нет других указаний в нормативной документации). За животными наблюдают 7 дней.

Специфическая активность. Не менее 150 МЕ/мл. Испытание проводят биологическим методом на беспородных белых мышах или мышах линии Balb/c массой  г.

Специфическую активность испытуемого образца определяют в сравнении со стандартным образцом специфической активности иммуноглобулина антирабического из сыворотки крови лошади, калиброванным по отношению к международному стандарту специфической активности иммуноглобулина антирабического.

Предварительно испытуемый и стандартный образцы разводят 0,9% стерильным раствором натрия хлорида (если нет других указаний в нормативной документации) до получения конечного разведения (после добавления разрешающего разведения фиксированного вируса бешенства штамм "CVS") в соотношении 1:500; 1:1000; 1:2000; 1:4000 и т.д. в зависимости от предполагаемой специфической активности испытуемого образца. Разведения образцов для заражения животных указывают в нормативной документации. После этого в каждую пробирку с полученными разведениями добавляют разрешающее разведите вируса бешенства, содержащее от 100 до 500 LD₅₀, в объеме, равном объему испытуемого и стандартного образца. Содержимое пробирок перемешивают путем встряхивания. Расчет разрешающего разведения вируса бешенства для испытания проводят на основании результатов предварительного титрования вируса бешенства (определения инфекционной активности вируса).

Для определения точного количества доз вируса бешенства, взятого в опыт, одновременно с разведениями испытуемого образца готовят разведения вируса бешенства. Разрешающее разведение вируса бешенства смешивают с 2% раствором нормальной лошадиной сыворотки, приготовленным с применением стерильной воды очищенной или воды для инъекций, в соотношении 1:1. Полученную смесь условно принимают за исходное разведение 10⁰ и готовят последовательные десятикратные разведения вируса (10^-1, 10^-2, 10^-3) в 2% растворе нормальной лошадиной сыворотки. Сыворотку лошадиную нормальную предварительно инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин.

Пробирки с разведениями испытуемого образца, стандартного образца и фиксированного вируса бешенства штамм "CVS" инкубируют при температуре 37°С в течение  мин или при температуре  в течение  ч. Затем из каждого полученного разведения смеси вводят интрацеребрально лабораторным животным по 0,03 мл (не менее 10 мышей на каждое разведение испытуемого и стандартного образцов и не менее 10 мышей на каждое разведение фиксированного вируса бешенства штамм "CVS"). За мышами наблюдают в течение 14 сут. При оценке результатов опыта учитывают заболевших или павших животных с 5 по 14 сут.

После окончания опыта вычисляют точное количество вируса, содержавшееся в 0,03 мл разрешающего разведения, по методу Рида и Менча.

Расчет специфической активности антирабического иммуноглобулина производят по следующим формулам:

1) Определяют защитный титр ( КР₅₀ - разведение, при котором выжило 50% экспериментальных животных) испытуемого и стандартного образца:

 

,

 

где А - логарифм обратной величины разведения, при котором смертность животных ниже 50%;

В - показатель смертности ниже 50%;

С - показатель смертности выше 50%;

Д - логарифм кратности разведения.

 

КР₅₀=10^-Т

 

2) Специфическую активность испытуемого иммуноглобулина (СА) определяют в МЕ/мл относительно специфической активности стандартного образца по формуле:

 

,

 

где А - обратная величина защитного титра испытуемого иммуноглобулина;

В - обратная величина защитного титра стандартного образца;

n - специфическая активность стандартного образца в ME.

В случае, если при проведении испытания специфическая активность иммуноглобулина не соответствует нормативным требованиям, допускается проведение повторного испытания.

 

Иммуноглобулин антирабический, разведенный 1:100

 

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость. Определяют визуально.

Прозрачность. Прозрачный раствор с оптической плотностью не более 0,05. Определение проводят в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях" в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 540 нм по сравнению с водой очищенной. Метод определения указывают в нормативной документации.

Цветность. Бесцветный раствор с оптической плотностью не более 0,15. Определение проводят спектрофотометрическим методом в соответствии с ОФС "Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях" в кюветах с толщиной слоя 3 мм при длине волны 400 нм по сравнению с водой очищенной. Метод определения указывают в нормативной документации.

рН. От 6,6 до 7,4. Определяют потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Белок. От 0,015 до 0,115%. Определяют колориметрическим методом с биуретовым реактивом в соответствии с ОФС "Определение белка".

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание на отсутствие бактерий и грибов проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации с использованием тиогликолевой среды в соответствии с ОФС "Стерильность".

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты". Указывают вид животного, из крови которого получают препарат.

Транспортирование и хранение. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты" при температуре от 2 до 8°С.