Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину оспенную инактивированную, применяемую в качестве иммунобиологического лекарственного препарата (ИЛП). Вакцина представляет собой вирус осповакцины, выращенный на скарифицированной коже телят, обработанной хлоргексидина биглюконатом и инактивированный гамма-излучением Со⁶⁰. Одна прививочная доза вакцины содержит активный компонент - инактивированный антиген вируса осповакцины - 50 мкг (величина расчетная определяется но содержанию общего белка); стабилизаторы: желатин - 1% и сахароза - 5% в конечной концентрации; соли буферной системы - натрия гидрофосфат додекагидрат и лимонная кислота моногидрат. Вакцина не содержит антибиотиков и консервантов.

Вакцина предназначена для вакцинации детей с двухлетнего возраста, подростков и взрослых на первом этапе при двухэтапном методе вакцинации; на втором этапе применяют вакцину оспенную живую.

Производство

Все этапы производства вакцины должны осуществляться с соблюдением установленных требований к правилам организации производства и контролю качества лекарственного препарата, гарантирующих его качество и безопасность для человека.

Производство вакцины оспенной инактивированной должно проводиться в отдельных изолированных помещениях, в которых не допускается производство других лекарственных средств. Условия производства должны соответствовать требованиям санитарных правил "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

Этапы производства включают получение оспенного соскоба с кожи телят; очистку оспенного соскоба от белка кожи центрифугированием; приготовление жидкой вакцины; инактивацию гамма-излучением Со⁶⁰ и внесение стабилизатора; розлив и герметизацию ампул в атмосфере азота.

В процессе производства обязательным является испытание качества исходных материалов, ляпиновакцины I, II и III генераций посевного вируса. Определение общего белка проводят в полуфабрикате вакцины после разведения буферным раствором до добавления стабилизатора. Определение проводят колориметрическим методом в соответствие с ОФС "Определение белкового азота с реактивом Несслера с предварительным осаждением белкового материала в иммунобиологических лекарственных препаратах". Регламентированная норма 100-200 мкг/мл.

Обязательным условием при производстве препарата является определение посторонних примесей (хлоргексидина биглюконата). использующегося в виде 0,5% раствора для обработки шкур телят с оспенным детритом. Содержание примеси хлоргексидина биглюконата определяют в полуфабрикате на стадии получения оспенного соскоба. Содержание хлоргексидина биглюконата в полуфабрикате не должно превышать 0,05% при определении спектрофотометрическим методом.

Требования к животным. В качестве продуцентов для производства вакцины оспенной инактивированной и посевного материала используют телят крупного рогатого скота. Животные должны поступать из хозяйств, благополучных в отношении инфекционных агентов, в том числе и прионовой природы. Каждая партия животных должна сопровождаться ветеринарным свидетельством, подтверждающим отсутствие инфекционных заболеваний. Все поступившие телята должны пройти 30-дневный карантин.

Требования к производственному штамму. В качестве вакцинного штамма используют вирус осповакцины, штамм Л-ИВП, полученный путем накожных пассажей на кроликах и телятах вакцины, приготовленной из штамма Lister института Листера (Великобритания). Штамм Л-ИВП хранится в коллекции производственных штаммов на предприятии-изготовителе. Для поддержания стабильных свойств штамма проводят I пассаж исходного штамма на коже кролика. Материалом исходного штамма служит ляпино-вакцина III генерации. В результате пассирования исходного штамма на кроликах получают ляпину. Посевной вирус I генерации получают в результате пассажа ляпины на коже теленка. Посевной вирус II генерации получают путем пассажа посевного вируса I генерации на коже теленка. Для приготовления вакцины используют только ляпиновакцину III генерации. Взвесь посевного вируса должна отвечать следующим требованиям:

- может содержать суммарно не более 50 посторонних микроорганизмов в 1 мл, в том числе аэробных и факультативно-анаэробных бактерий и грибов;

- не должна содержать бактерий семейства Enterobacteriaceae и вида Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus, а также патогенных анаэробных бактерий;

- быть генетически однородной, допускается образование на хорионаллантоисных оболочках (ХАО) куриных эмбрионов не более 10 поражений поверхностного диффузного типа на 1000 типичных оспин (от 0,5 до 3 мм);

- на скарифицированной коже кроликов образовывать типичные вакцинальные поражения (оспины);

- не вызывать некрозы при внутрикожном введении кроликам 10⁴ ООЕ/0,1 мл (ООЕ - оспообразующие единицы);

- не вызывать гибель кроликов при введении в мозг 10⁴ ООЕ/0,1 мл;

- быть безвредной для морских свинок при введении подкожно 1 мл посевного вируса и для белых мышей при введении 0,2 мл посевного вируса подкожно;

- иметь специфическую активность не менее 1·10⁹ ООЕ/мл.

Производственный штамм контролируется при получении каждой генерации посевного вируса.

Испытания

Описание. Пористая масса от белого до серо-белого цвета, гигроскопичная.

Подлинность. Вакцина должна вызывать образование вируснейтрализующих антител к вирусу осповакцины в сыворотке крови белых крыс, однократно иммунизированных внутривенно 1 дозой вакцины. Определение проводят в соответствии с разделом "Антигенная активность".

При неудовлетворительных результатах контроль повторяют, как при первичном испытании. При повторном испытании при получении неудовлетворительных результатов серию препарата бракуют.

Время растворения. Должна полностью растворяться в 0,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида при встряхивании в течение 3 мин. Метод определения - визуальный. После растворения вакцина должна представлять собой бесцветную или желтоватого цвета опалесцирующую жидкость.

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН (восстановленного препарата). От 6,8 до 7,6. Испытания проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Потеря в массе при высушивании. Не более 3,0%. Определение проводят в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Стерильность. Вакцина должна быть стерильной. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Стерильность", если в нормативной документации нет других указаний.

Пирогенность. Должна быть апирогенной. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Тест - доза вводимого препарата должна составлять 0,5 мл на кролика.

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксичной. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Тест-доза - по 0,5 мл подкожно 2 морским свинкам массой 250 - 300 г и по 0,5 мл внутрибрюшинно 5 белым мышам массой 17 - 20 г. Вакцину растворяют прилагаемым растворителем.

При получении неудовлетворительных результатов контроль повторяют на удвоенном количестве образцов. При получении неудовлетворительных результатов при повторном испытании серию препарата бракуют.

Специфическая безопасность. Не должна содержать живого вируса осповакцины. Полноту инактивации вируса осповакцины испытывают на ХАО 12-дневных куриных эмбрионов (КЭ).

Примечание. Используют КЭ от кур породы "Леггорн", "Роменбраун". "Родонит-2", "Изобраун" или "Хайсек" или пород кур, эмбрионы которых чувствительны к вирусу осповакцины. КЭ получают из хозяйств, свободных от вирусных и других возбудителей, патогенных для человека.

Подготовка КЭ. Проводят овоскопию КЭ в затемненном помещении. Каждый эмбрион просматривают в направленном пучке света. Свет должен падать сверху на тупой конец яйца. Яйцо с погибшим эмбрионом или с кровоизлиянием под оболочкой бракуют. В центре воздушного мешка на тупом конце яйца и на боковой поверхности яйца, на участке между сосудами и их ответвлениями карандашом делают отметку. В местах отметок с соблюдением правил асептики пропиливают бормашиной с абразивным диском отверстия (щели) длиной 3 - 4 мм и шириной 1,5 мм, не повреждая оболочки. Яйцо укладывают так, чтобы отверстие на боковой стороне было обращено вверх. Подскорлупную оболочку в центре воздушного мешка прорывают плоской полукруглой хирургической иглой. Затем на отверстие, расположенное на боковой поверхности, вносят 0,1 мл 0,004 М стерильного фосфатно-цитратного буферного (ФЦБ) раствора Мак-Ильвейна, подогретого до температуры , и той же иглой осторожно продавливают подскорлупную оболочку. После этого практически вся капля раствора проходит под подскорлупную оболочку и частично отслаивает ХАО.

Из отверстия в центре воздушною мешка резиновой грушей осторожно отсасывают воздух до полного опускания ХАО и создания искусственного воздушного мешка под боковой щелью. Для контроля наличия и величины искусственного воздушного мешка вновь проводят овоскопию и бракуют эмбрионы, имеющие кровоизлияния, воздушные мешки под ХАО или без искусственных воздушных мешков. Яйца с опущенной ХАО помещают на лотки отверстием вверх и выдерживают 2 ч в термостате при температуре . Затем проводят овоскопию повторно и бракуют эмбрионы с воздушными мешками под ХАО, без искусственных воздушных мешков и с кровоизлияниями.

Постановка основного опыта. При испытании специфической безопасности вакцины используют 20 подготовленных КЭ и 10 ампул вакцины. Содержимое ампулы с вакциной растворяют в 0,5 мл ФЦБ. Содержимое каждой ампулы контролируют на 2 эмбрионах. По 0,1 мл растворенной вакцины наносят на ХАО одного эмбриона и равномерно распределяют по оболочке осторожным круговым вращением яйца. Инокулированные эмбрионы укладывают отверстием на боковой поверхности вверх и помещают в термостат на 48 ч при температуре , затем проводят учет результатов. Параллельно определяют чувствительность КЭ к вирусу осповакцины. Для этого используют не менее 12 подготовленных КЭ и стандартный образец активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины в соответствии с инструкцией по применению. Инкубируют параллельно с основным опытом. Через 48 ч КЭ вскрывают, разрезая скорлупу по длинной оси яйца. Отслаивают пинцетом участок ХАО, выстилающий полость искусственного мешка, и отмывают его от крови и белка водой или ФЦБ. Каждую оболочку просматривают на черном фоне па наличие поражений. Препарат не должен вызывать специфических поражений на ХАО куриных эмбрионов. В тесте должно быть подтверждено установленное значение показателя "Специфическая активность" стандартного образца активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины. При соблюдении данных условий делают заключение об отсутствии живого вируса в испытуемом образце вакцины.

В случае обнаружения типичных оспин в основном опыте проводят контроль удвоенного количества испытуемых образцов вакцины. При повторном обнаружении типичных оспин на ХАО КЭ испытуемую вакцину бракуют. В случае обнаружения неспецифических поражений, участок ХАО измельчают и готовят суспензию в 2 мл ФЦБ. Взвесь центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Надосадочную жидкость наносят по ОД мл на ХАО куриных эмбрионов. Отсутствие типичных поражений считают доказательством инактивации вируса. При обнаружении на ХАО КЭ специфических оспин вакцину бракуют.

Примечания.

1. Приготовление ФЦБ раствора Мак-Ильвейна 0,004 М, рН (7,2-7.4). Готовят растворы 1 и 2.

Раствор 1: Лимонная кислота - 2,1 г; Вода очищенная - 100 мл.

Раствор 2: В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 28,4 г натрия гидрофосфата безводного или 35,6 г натрия гидрофосфата дигидрата, или 71, 6 г натрия гидрофосфата додекагидрата, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Смешивают 2 мл раствора 1 и 18 мл раствора 2 в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Полученный раствор должен иметь рН 7,2-7,4. Если рН полученного раствора более 7,4, его доводят до нормы раствором 1. В случае, если рН полученного раствора меньше 7,2, приготовление раствора повторяют. Буферный раствор стерилизуют при температуре  и давлении  МПа в течение 8-30 мин (в зависимости от объема) или фильтруют через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и хранят при температуре от 2 до 8°С. Срок хранения от 10 до 30 сут в зависимости от способа укупорки флаконов (способ укупорки флаконов должен быть указан в нормативной документации).

Антигенная активность. Среднегеометрический титр (СГТ) вируснейтрализующих антител (ВНА) к вирусу осповакцины в сыворотках крови белых крыс, иммунизированных внутривенно 1 дозой вакцины, должен быть не менее 1:80. Контроль проводят на 6 белых крысах массой 80-100 г линии Wistar или нелинейных белых крысах без различия пола. Крысам вводят внутривенно в хвостовую вену растворенный препарат испытуемой вакцины в объеме 0,5 мл. Через 28 сут производят взятие крови от каждой крысы и получают сыворотки. Для контроля опыта получают нормальную сыворотку крови от неиммунной крысы. Все полученные сыворотки прогревают при температуре  в течение 30 мин и исследуют в реакции нейтрализации. Постановку реакции нейтрализации проводят на ХАО 12-дневных КЭ. Для постановки реакции используют подготовленные КЭ (раздел "Специфическая безопасность") и в качестве вируса стандартный образец активности специфичности и некротической активности оспенной вакцины. Определяют рабочее разведение вируса титрованием на ХАО 12-дневных КЭ. Для этого готовят ряд последовательных десятикратных разведений вируса на ФЦБ (в соответствии с инструкцией по применению стандартного образца активности, специфичности и некротической активности оспенной вакцины). Каждое разведение вируса в объёме 0,1 мл вводят на ХАО 6 КЭ. Инкубируют в термостате 48 ч при температуре . КЭ вскрывают, подсчитывают количество развившихся на ХАО оспин, рассчитывают среднее арифметическое значение оспин для каждого разведения. При постановке реакции нейтрализации используют то разведение стандартного образца, которое дает на ХАО куриных эмбрионов 40 - 60 оспин (рабочее разведение). Готовят двукратные разведения исследуемых сывороток на ФЦБ растворе Мак-Ильвейна от 1:10 до 1:640 и разведения нормальной сыворотки 1:10 и 1:20 в объёме по 0,5-1 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем вируса в рабочем разведении. При этом разведение сывороток увеличивается вдвое. Соответственно в смесях получают разведения исследуемых сывороток от 1:20 до 1:1280 и нормальной сыворотки 1:20-1:40. Смеси выдерживают при температуре  в течение 2 ч. На ХАО КЭ наносят по 0,1 мл смеси, используя для каждой смеси по 5-6 эмбрионов. Инкубацию и вскрытие эмбрионов проводят так же, как при определении специфической безопасности.

Учет результатов. Подсчитывают количество развившихся на ХАО оспин и определяют их среднеарифметическое значение для каждого разведения сыворотки. Находят среднеарифметическое значение числа оспин, развившихся при исследовании 2 разведений нормальной сыворотки. Титром ВНА считают конечное разведение иммунной сыворотки, дающее нейтрализацию 50% и более оспин от среднеарифметического числа, определенного в контроле с нормальной сывороткой. Допускается разброс вируснейтрализующих титров сывороток от 1:20 до 1:1280.

Пример расчета СГТ ВНА. При выявлении в реакции нейтрализации следующих титров ВНА в сыворотках 1:20, 1:80, 1:640, 1:640, 1:160, 1:160 для удобства расчета СГТ необходимо все значения привести к единому знаменателю (1:160 = 4:640, 1:80 = 8:640. 1:20 = 32:640), тогда:

.

Растворитель, выпускаемый в комплекте с препаратом

Растворитель - 0,9% раствор натрия хлорида.

Описание. Прозрачная бесцветная жидкость.

Подлинность. Растворитель дает характерную реакцию на хлориды (образуется белый творожистый осадок). Определение проводят одновременно с количественным определением в соответствии с ОФС "Определение хлоридов методом обратного осадительного титрования в иммунобиологических лекарственных препаратах".

Растворитель дает характерную реакцию на ионы натрия: 5 мл растворителя, упаренные до 1 мл, дают характерную реакцию на ионы натрии (окрашивание пламени в желтый цвет).

Прозрачность. Должен быть прозрачным. Определение проводит в соответствии с ОФС "Прозрачность и степень мутности жидкостей".

Цветность. Должен быть бесцветным. Определение проводит в соответствии с ОФС "Степень окраски жидкостей".

рН. От 5,5 до 7,5. Испытания проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и в глазных лекарственных формах".

Извлекаемый объем. Не менее номинального. Испытание проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Бактериальные эндотоксины. Предельное содержание бактериальных эндотоксинов в растворителе должно быть не более 0,25 ЕЭ/мл. Определение проводит в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины".

Стерильность. Должен быть стерильным. Испытание проводит в соответствии с ОФС "Стерильность", если в нормативной документации нет иных указаний.

Количественное определение. В 1 мл растворителя должно быть от 0,0087 до 0,0093 г натрия хлорида. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение хлоридов методом обратного осадительного титрования в иммунобиологических лекарственных препаратах".

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С. Допускается однократное кратковременное (не более 24 ч) транспортирование при температуре от 9 до 20°С.