Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивированная жидкая сорбированная или сухая в комплекте с растворителем алюминия гидроксида	ФС.3.3.1.0031.15
	Взамен ФС 42-3259-96

Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину клещевого энцефалита, инактивированную формальдегидом, культуралыную цельновирионную очищенную концентрированную, жидкую сорбированную на минеральном сорбенте - алюминия гидроксиде, или сухую с алюминия гидроксидом в качестве растворителя. Основным активным компонентом вакцины является инактивированный антиген (протективный поверхностный белок Е) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

Вакцина не содержит антибиотиков и консервантов.

Вакцина предназначена для профилактики клещевого энцефалита и для иммунизации доноров с целью получения специфического иммуноглобулина.

 

Производство

 

Производство вакцины клещевого энцефалита должно быть организовано при соблюдении правил организации производства и контроля качества лекарственного препарата, гарантирующих качество и безопасность для человека, а также условий работы с вирусом 2 группы патогенности (опасности) - ВКЭ.

Технология производства вакцины состоит из нескольких этапов.

1. Подготовка и ведение производственного штамма ВКЭ.

2. Подготовка и ведение первично-трипсинизированной культуры клеток куриного эмбриона (взвешенной или монослойной). В качестве субстрата для приготовления ВКЭ могут быть использованы перевиваемые клеточные линии, рекомендованные ВОЗ для этой цели, в частности, перевиваемая линия клеток Vero.

3. Заражение клеточной культуры, репродукция вируса и получение вирусного сбора.

4. Инактивация вирусного сбора формальдегидом, проведение очистки и концентрации вакцинного вирусного антигена, стабилизация антигена альбумином крови человека и сахарозой, получение готовой формы вакцины: сорбция жидкого антигена или его лиофилизация.

Размножение ВКЭ осуществляется на первично-трипсинизированной культуре клеток куриных эмбрионов. Куриные эмбрионы должны поступать из птицеводческих хозяйств, проверенных и аттестованных на отсутствие заболеваний птиц. Перед заражением вирусом клеточные культуры должны быть проверены на отсутствие контаминирующих агентов - вирусов, бактерий, грибов, микоплазм.

Состав. Доза вакцины содержит специфический инактивированный антиген ВКЭ - активный компонент, а также вспомогательные вещества (содержание расчетное), состав и количество которых на дозу вакцины указывают в нормативной документации предприятия.

При получении готовой формы вакцины могут применяться стабилизаторы активности очищенного концентрированного вакцинного антигена - 10 или 20% растворы альбумина крови человека и сахароза. Перед использованием в производстве альбумин человека должен тестироваться валидированными методами на отсутствие антител к ВИЧ-1, ВИЧ-2, к вирусу гепатита С и поверхностному антигену вируса гепатита В (HbsAg).

 

Производственные штаммы и тест-штаммы

 

Используются производственные штаммы ВКЭ, полученные путем пассирования ВКЭ через мозг нелинейных белых мышей. Для ведения производственного штамма используется система посевных серий. Исходный лиофилизированный производственный штамм хранится при температуре не выше минус 60°С. Исходный производственный штамм служит источником получения штаммового запаса, маточного и посевного вируса путем пассажей вируса через мозг нелинейных белых мышей.

Полученный после заражения культуральный вирусный сбор подвергается инактивации формальдегидом с последующей очисткой и концентрацией вакцинного антигена методами ультрафильтрации и/или гель-хроматографии. Инактивированный вакцинный антиген контролируют на отсутствие живого ВКЭ.

При ведении штаммов на производстве должна использоваться система посевных серий, т.е. от исходного штамма до получения вирусного материала для заражения культуры клеток должно быть проведено не более 5 пассажей через мозг нелинейных белых мышей.

При приготовлении вирусного материала для получения новой серии производственного штамма ВКЭ должен проводиться контроль стерильности, биологической активности и типоспецифичности вируса.

Производственный штамм и тест-штамм ВКЭ должны отвечать следующим требованиям:

- не должны содержать контаминирующих агентов;

- индекс нейтрализации типоспецифическими иммунными сыворотками к ВКЭ в реакции нейтрализации при внутримозговом заражении нелинейных белых мышей массой 7 - 9 г, в возрасте 12-14 сут, не менее 1000;

- титр вируса при внутримозговом заражении нелинейных белых мышей массой 7 - 9 г возрастной категории 12-14 сут - не менее , при подкожном и внутрибрюшинном заражении мышей той же категории титр не менее .

Производственные лиофилизированные штаммы ВКЭ контролируются не реже 1 раза в 5 лет.

Для производства и контроля вакцины по показателю "Специфическая активность" должны использоваться вирулентные штаммы ВКЭ, выделенные из вирусофорных клещей или от больных/погибших от клещевого энцефалита людей.

Штаммы должны быть депонированы в официальной Государственной коллекции вирусов. Производственные или тест-штаммы должны быть закреплены на установленном уровне пассажей, лиофилизированы и заложены на долгосрочное хранение.

 

Испытания

 

Описание. Гомогенная суспензия белого цвета без посторонних включений (для сорбированной жидкой вакцины). Пористая масса белого цвета, гигроскопична (для лиофилизированной вакцины). Определение проводят визуально.

Восстановленный препарат. Гомогенная непрозрачная суспензия белого цвета, при отстаивании разделяющаяся на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок белого цвета. При встряхивании хлопья, конгломераты и посторонние частицы должны отсутствовать. Определение проводят визуально.

Подлинность. Должна вызывать специфический иммунитет к ВКЭ при иммунизации мышей линии Balb/c.

Определение проводят биологическим методом (раздел "Специфическая активность").

Время растворения. Не более 3 мин (для лиофилизированной вакцины). Определение проводят визуально.

Механические включения. Должна соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в парентеральных лекарственных формах и глазных лекарственных формах".

Время седиментационной устойчивости. Суспензия, образующаяся при встряхивании, не должна расслаиваться в течение 3 мин. Определение проводят визуально.

Количественное определение антигена. Определение проводят методом иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с ОФС "Метод иммуноферментного анализа" с использованием коммерческих наборов реагентов для выявления антигена ВКЭ. Проведение ИФА и учет результатов осуществляют согласно инструкции по применению набора реагентов. Титр антигена в вакцине клещевого энцефалита должен быть не менее 1:128. Методика должна быть изложена в нормативной документации. Возможно определение количества антигена ВКЭ в мкг/мл методом ИФА с помощью других валидированных наборов реагентов. Методика постановки должна быть изложена в нормативной документации.

Извлекаемый объём. Не менее номинального (для жидкой сорбированной вакцины). Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Потеря в массе при высушивании. Не более 2,0% (для лиофилизированной вакцины). На 2 параллельных испытания отбирают 0,15-0,20 г испытуемого образца. Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Содержание алюминия. От 0,60 до 1 мг/мл (для жидкой сорбированной вакцины).

Определение проводят методом комплексонометрического титрования в соответствии с ОФС "Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах".

Сахароза. От 20 до 60 мг/мл (для жидкой сорбированной вакцины).

Определение проводят колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Определение сахаров спектрофотометрическим методом".

Формальдегид. Не более 20 мкг/мл (для жидкой сорбированной вакцины). Определение проводят колориметрическим методом в соответствии с ОФС "Количественное определение формальдегида в иммунобиологических лекарственных препаратах".

Стерильность. Должна быть стерильной. Препарат (лиофилизированную вакцину) предварительно растворяют водой для инъекций. Определение проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Бактериальные эндотоксины. Не более 50 ЕЭ/мл. Определение проводят методом гель-тромб теста в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины".

Аномальная токсичность. Должна быть нетоксична. Препарат (лиофилизированную вакцину) предварительно растворяют водой для инъекций. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Тест-доза для морских свинок - по 1 дозе вакцины подкожно (если нет других указаний в нормативной документации предприятия), для белых мышей - по 1 дозе вакцины внутрибрюшинно, период наблюдения за животными составляет 7 сут.

рН. От 7,4 до 7,8. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Специфическая активность (иммуногенность). Должна быть специфически активна. Минимальная иммунизирующая доза вакцины (МИД₅₀) должна быть в пределах от 0,001 до 0,017 мл. Определение проводят биологическим методом.

Для проведения контроля используют необходимое количество образцов вакцины в зависимости от объема 1 прививочной дозы для дальнейшего приготовления 4 последовательных разведений. В качестве препарата сравнения применяется стандартный образец (СО) вакцины клещевого энцефалита, аттестованный в установленном порядке.

Содержимое ампул вакцины или СО объединяют в одной емкости; средой, указанной в нормативной документации, готовят 4 последовательные разведения: для дозы 0,5 мл - 1:10; 1:32; 1:100; 1:320, а для дозы 0,25 мл - 1:5; 1:16; 1:50; 1:160. Для лиофилизированной вакцины клетевого энцефалита содержимое ампул предварительно растворяют в воде для инъекций. Емкости с приготовленными разведениями испытуемой вакцины и стандартного образца вакцины сохраняют на льду на время постановки опыта.

Для иммунизации используют мышей линии Balb/c массой 14-16 г, возрастной категории 40-42 сут, без различия пола. На каждое разведение испытуемой вакцины или СО используют по 10 мышей. Иммунизацию проводят трёхкратно с интервалом между инъекциями 1-3 сут. Животным вводят подкожно соответствующие разведения препаратов в объеме 0,5 мл (для вакцины в детской дозировке - 0,25 мл). Для каждой иммунизации готовят свежие разведения испытуемой вакцины и СО вакцины.

Одновременно в 1 день иммунизации комплектуют контрольную группу мышей той же партии для определения рабочей летальной дозы тест-штамма (LD₅₀). В качестве тест-штамма используют вирулентный штамм "Абсеттаров" ВКЭ.

Через 7-9 сут после третьей иммунизации мышам внутрибрюшинно вводят 0,25 мл рабочего разведения ВКЭ тест-штамма "Абсеттаров", приготовленного с использованием среды, указанной в нормативной документации, и содержащего рабочую летальную дозу 100-1000LD₅₀. Параллельно для подтверждения рабочей дозы ВКЭ (LD₅₀), взятой в испытания, используют рабочее разведение вируса и его десятикратные разведения. Рабочее разведение вируса; 1:10; 1:100; 1:1000; 1:10000. Разведения готовят на среде, указанной в нормативной документации. Указанные выше разведения ВКЭ вводят мышам контрольной группы внутрибрюшинно по 0,25 мл, используя по 6 мышей на каждое разведение вируса.

За животными ведут ежедневное наблюдение и регистрируют заболевших и павших мышей. Мышей, павших в течение первых 3 сут после заражения вирусом, исключают из опыта. Учёт результатов проводят на 14 сут после введения вируса.

На основании полученных результатов рассчитывают рабочую летальную дозу (LD₅₀) вирулентного вируса тест-штамма "Абсеттаров", введенного иммунизированным испытуемой вакциной или СО мышам, а также МИД₅₀ (минимальную иммунизирующую дозу).

1. Определение рабочей летальной дозы LD₅₀ (PLD₅₀) вируса тест-штамма "Абсеттаров". Рабочая LD₅₀ вируса, введенная иммунизированным мышам, должна содержать от 100 до . Расчёт проводят по методу Рида и Менча (табл. 1).

 

Таблица 1 - Определение рабочей LD₅₀ тест-штамма "Абсеттаров"

 

Разведение вируса	Количество мышей					Гибель, %
	всего	абсолютные данные		кумулятивные данные
		погибло	выжило	погибло	выжило
100 - "рабочее"	6	6	0	18	0	100
10-1	6	6	0	12	0	100
10-2 (В)	6	4	2	6	2	75(в)
10-3	6	2	4	2	6	25(a)
10-4	6	0	6	0	12	0

 

Пример расчёта: Определение рабочей LD₅₀ тест-штамма "Абсеттаров".

 

;

 

;

 

где В - наибольшее разведение вируса, при котором наблюдается гибель более 50% животных;

в - процент летальности мышей при разведении вируса (В);

а - процент летальности мышей при наименьшем разведении вируса, вызвавшем гибель менее 50% животных.

Следовательно, реальная доза вируса, введенная мышам при испытании иммуногенности, содержала 316,2LD₅₀ вирулентного тест-штамма "Абсеттаров" в 0,25 мл.

2. Определение МИД₅₀. МИД₅₀ - минимальная иммунизирующая доза вакцины КЭ, которая выражается как отношение объема разовой дозы вакцины, введенной в опыте животным (в мл), к показателю ПР₅₀ (протективное разведение вакцины).

ПР₅₀ - это наименьшее разведение вакцины и/или СО, которое защищает 50% иммунизированных мышей от гибели при заражении ВКЭ тест-штамма "Абсеттаров" в дозе от 100-1000LD₅₀.

Для определения МИД₅₀ испытуемой серии или СО вакцины предварительно по методу Рида и Менча вычисляют протективное разведение вакцины и СО (табл. 2).

 

Таблица 2 - Определение ПР₅₀ вакцины и/или СО

 

Разведение вакцины	Количество мышей					% выживших мышей
	всего	абсолютные данные		кумулятивные данные
		погибло	выжило	погибло	выжило
1:10	10	0	10	0	18	61,54 (а) 18,75 (в)
1:32 (А)	10	5	5	5	8
1:100	10	8	2	13	3
1:320	10	9	1	22	1

 

;

 

 

где: А - наибольшее разведение вакцины, защищающее при иммунизации более 50% мышей от гибели;

а - процент выживаемости мышей при иммунизации дозой вакцины (А);

в - процент выживаемости мышей при наименьшем разведении вакцины, защищающем от гибели менее 50% мышей;

0,5 - логарифм кратности разведения вакцины в опыте.

Минимальная иммунизирующая доза (МИД₅₀) рассчитывается отношением:

МИД₅₀=объем разовой дозы вакцины (мл), введенной мышам/ПР₅₀.

= Серия вакцины клещевого энцефалита считается специфически активной (иммуногенной), если минимальная иммунизирующая доза вакцины (МИД₅₀) находится в пределах от 0,001 до 0,017 мл; МИД₅₀ СО соответствует аттестованным характеристикам.

Для сопоставления результатов контроля испытуемой серии вакцины и СО возможно вычисление коэффициента сравнительной иммуногенности (К), при этом его значение должно быть больше или равно 0,5:

 

K=(0,0125·СТ₂)/(L·СТ₁),

 

где: СТ₁ - , указанный в свидетельстве на СО;

СТ₂ -  в данном опыте. СТ₂ может иметь значения в интервале от 0,5СТ₁ до 2СТ₁:

L - МИД₅₀ исследуемой серии вакцины;

0,0125 - числовой коэффициент, соответствующий содержанию в объеме вакцины клещевого энцефалита, вводимом мышам однократно.

 

.

 

При известном значении СТ₁=0,007 рассчитывают значение коэффициента сравнительной иммуногенности:

 

.

 

При неудовлетворительных результатах определение специфической активности (иммуногенности) повторяют, используя такое же количество образцов.

Необходимо соблюдать санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами 1 - 2 групп патогенности (опасности)", т.к. выполнение контроля специфической активности вакцины связано с потенциальной опасностью заражения ВКЭ.

Полнота сорбции антигена. Полнота сорбции антигена ВКЭ должна составлять от 80 до 100%. Метод предназначен для жидкой сорбированной вакцины.

Определение проводят методом ИФА по отношению иммуноферментной активности вакцинного антигена в образцах готовой формы вакцины и в надосадочной жидкости после центрифугирования образцов вакцины. Определение проводят по методике, изложенной в фармакопейной статье или нормативной документации.

Расчёт полноты сорбции антигена. Для расчёта полноты сорбции (ПС) вакцинного антигена на сорбенте - алюминия гидроксиде - вычисляют относительную активность антигена ВКЭ в надосадочной жидкости, сравнивая показатели А - оптические плотности разведений испытуемых образцов сорбированной вакцины и надосадочной жидкости методом параллельных линий (программа "PARALINE" или аналогичная).

Полноту сорбции (ПС) антигена ВКЭ определяют как разницу между 100% (активность антигена в испытуемом образце вакцины) и полученным значением активности антигена в надосадочной жидкости (в %) по формуле:

 

ПС=100%-(A·100)%,

 

где: А - значение относительной активности ВКЭ в надосадочной жидкости испытуемой вакцины, рассчитанное с помощью компьютерной программы "PARALINE" или другой аналогичной.

Если по результатам ИФА во всех пробах надосадочной жидкости испытуемой вакцины антиген ВКЭ не выявляется (оптическая плотность испытуемых образцов ниже оптической плотности критической), то полнота сорбции вакцинного антигена в готовой вакцине равна 100%, без проведения вычислений.

Растворитель, выпускаемый в комплекте с препаратом (для лиофилизированной вакцины). В состав растворителя входят гель алюминия гидроксида от 0,60 до 1 мг/мл и вода для инъекций до 1 мл.

Описание. Гомогенная непрозрачная суспензия белого цвета, при отстаивании разделяющаяся на бесцветную прозрачную жидкость и рыхлый осадок белого цвета. При встряхивании хлопья, конгломераты и посторонние частицы должны отсутствовать. Определение проводят визуально.

Содержание алюминия. От 0,60 до 1 мг/мл. Определение проводят комплексонометрическим методом титрования в соответствии с ОФС "Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических препаратах".

рН. От 5,5 до 8,5. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Время седиментационной устойчивости. Суспензия, образующаяся при встряхивании, не должна расслаиваться в течение 3 мин. Определение проводят визуально.

Стерильность. Должен быть стерильным. Не должен содержать бактерии и грибы. Определение проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичен. Определение проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Тест-доза: морским свинкам - 0,5 мл подкожно (если нет других указаний в нормативной документации предприятия), белым мышам - 0,5 мл внутрибрюшинно; период наблюдения за животными составляет 7 сут.

Извлекаемый объём. Не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентерального применения".

Упаковка и маркировка. Определение проводят в соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты". Дополнительно наносят предупредительные надписи: "Стерильно", "Перед употреблением встряхивать", "Замораживание не допускается", "Хранить в недоступном для детей месте", "Препарат не содержит консервантов и антибиотиков", "Препарат не содержит антитела к ВИЧ-1, 2, к гепатиту С и HbsAg".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С, если нет других указаний в фармакопейной статье или нормативной документации.