Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину гепатита В рекомбинантную, которая представляет собой поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), серотипа ad или ау, полученный методом рекомбинантной ДНК, который очищен с помощью последовательно применяемых физико-химических методов и адсорбирован на алюминия гидроксиде, разрешенном для парентерального введения. Антиген продуцируется культурой генетически трансформированных дрожжевых клеток (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris или Hansenula polymorpha).

Вакцина предназначена для профилактики вирусного гепатита В.

Производство

Производство вакцины должно осуществляться с соблюдением установленных требований к правилам организации производства и контроля качества лекарственных препаратов, гарантирующим ее качество, стабильность и безопасность для человека.

Состав препарата вакцины. В 1 мл препарата содержится 20 мкг поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) и вспомогательные вещества: сорбент - алюминия гидроксид 0,5 мг; консервант - тиомерсал 50 мкг (возможен выпуск препарата без консерванта); компоненты фосфатно-солевого буферного раствора.

Производственный штамм. Производственный штамм - рекомбинантный штамм дрожжей, продуцирующий HBsAg (указывают штамм-продуцент дрожжей и субтип вируса гепатита В). В нормативной документации производителя должны быть указаны полные характеристики рекомбинантного производственного штамма: клетки хозяина в сочетании с системой вектора экспрессии, отсутствие контаминирующих агентов; данные о стабильности плазмиды грибов в процессе хранения культуры.

Морфологические, культуральные и физико-биохимические свойства штамма-продуцента должны сохраняться при температуре минус  в течение 1 г.

Характеристика субстанции

Степень чистоты субстанции должна быть охарактеризована с помощью методов определения доли потенциальных загрязняющих белков в общем белке препарата - методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Степень очистки HBsAg должна быть не менее 95%. Количество остаточной ДНК дрожжевых клеток должно составлять не более 10 пг/доза.

Содержание HBsAg в субстанции определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). В качестве образца сравнения может использоваться высокоочищенный референс-препарат предприятия с известным содержанием HBsAg и белка. Образцы сравнения на основе продукта, содержащего консервант, не пригодны в случае испытания препаратов, не содержащих консервант.

Содержание липидов и углеводов должно определяться в субстанции (in balk) до процедуры адсорбции антигена на алюминия гидроксиде.

Пенициллин и другие антибиотики группы бета-лактамов не должны использоваться ни на одном из этапов производства.

В случае, когда при очистке субстанции используют моноклональные антитела (иммунологическая аффинная хроматография для очистки HBsAg), используемые антитела должны быть охарактеризованы и определена степень их очистки.

Референс-препараты. Для определения иммуногенности рекомбинантных вакцин против гепатита В могут быть использованы препараты сравнения (референс-препараты) - аналогичные вакцины того же производства, представляющие собой часть серии, иммуногенная активность которой была подтверждена в тестах in vivo.

Испытания

Описание. Гомогенная суспензия белого с серым оттенком цвета без видимых посторонних включений, при отстаивании разделяющаяся на 2 слоя: верхний - бесцветная прозрачная жидкость, нижний - белый осадок. При встряхивании суспензия должна легко ресуспендироваться.

Подлинность. Препарат должен содержать белок, идентичный поверхностному антигену вируса гепатита В (HBsAg). Определение проводят методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не более 0,1 МЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению (раздел "Специфическая активность"). Возможно определение подлинности методом электрофореза в ПААГ в редуцирующих условиях при окрашивании раствором серебра нитрата после десорбции белка согласно ОФС "Электрофорез" и ОФС "Электрофорез в полиакриламидном геле". При окрашивании геля раствором серебра нитрата должна выявляться основная полоса мономера с молекулярной массой  кДа, а также может присутствовать дополнительная менее интенсивная полоса димера с молекулярной массой  кДа.

Размер частиц. Суспензия вакцины должна свободно проходить в шприц через иглу N 0840. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения".

Время седиментационной устойчивости. Суспензия вакцины не должна расслаиваться в течение 5 мин после встряхивания. Определение проводят в соответствии с ОФС "Лекарственные формы для парентерального применения".

Механические включения. Видимые механические включения должны соответствовать требованиям ОФС "Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах".

рН. От 6,4 до 7,4. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия".

Извлекаемый объём. Должен быть не менее номинального. Определение проводят в соответствии с ОФС "Извлекаемый объем лекарственных форм для парентеральною применения".

Стерильность. Препарат должен быть стерильным. Испытания проводят методом прямого посева или мембранной фильтрации в соответствии с ОФС "Стерильность".

Бактериальные эндотоксины. Не более 30 ЕЭ/мл, если нет других указаний в нормативной документации производителя. Определение проводят в соответствии с ОФС "Бактериальные эндотоксины" (Гель-тромб тест. Качественный анализ).

Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным. Определение проводят в соответствии с ОФС "Пирогенность". Тест-доза - 0,5 мл на 1 кг массы кролика. Вводится внутривенно. Определение пирогенности является альтернативным определению бактериальных эндотоксинов.

Общий белок. Не более 25 мкг/мл. Определение проводят по методу Лоури с предварительной десорбцией белка в соответствии с ОФС "Определение белка колориметрическим методом (метод Лоури) в иммунобиологических лекарственных препаратах". Условия десорбции должны быть валидированы под конкретный препарат каждым производителем.

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным. Испытания проводят в соответствии с ОФС "Аномальная токсичность". Тест-доза для морских свинок - 1 мл (20 мкг) подкожно, для мышей - 1 мл (20 мкг) внутрибрюшинно. Наблюдение проводят в течение 7 сут.

Специфическая активность. Специфическую активность характеризуют, определяя содержание HBsAg методом ИФА или иммуногенную активность в тестах in vivo на мышах.

Определение содержания HBsAg методом ИФА. Содержание HBsAg должно быть не менее 80% по отношению к препарату сравнения. В качестве препарата сравнения используют референс-вакцину фирмы-производителя. Определение проводят в соответствии с ОФС "Метод иммуноферментного анализа" с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не ниже 0,1 МЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению.

Процедура приготовления растворов для разведений и рабочие разведения должны быть валидированы для конкретного препарата каждым производителем.

Определение содержания HBsAg в испытуемом образце вакцины проводят параллельно с определением содержания антигена в референс-вакцине фирмы-производителя. Процент содержания антигена в испытуемом препарате должен быть определен нормативной документацией. Испытания осуществляют в соответствии с инструкцией по применению используемой тест-системы.

Учет результатов. Содержание HBsAg в испытуемой вакцине и в образце сравнения рассчитывают методом параллельных линий (программа "PARALINE" или аналогичная). В результате автоматического дисперсионного анализа получают значения относительной активности поверхностного антигена по отношению к референс-препарату в процентах.

Иммуногенная активность на мышах (тест in vivo). Вакцина должна стимулировать выработку антител к HBsAg у однократно иммунизированных мышей линии Balb/c. Отношение дозы иммуногенной активности референс-препарата вакцины гепатита В, вызывающей выработку антител у 50% мышей (ЕД₅₀ референс-препарата), к ЕД₅₀ испытуемой вакцины должно быть не менее 0,5.

В качестве препарата сравнения используют референс-препарат производителя.

Раствор для разведения образцов вакцины - 0,9% раствор натрия хлорида, содержащий 0,35-0,65 мг/мл алюминия гидроксида. Данный раствор используют и при иммунизации животных в качестве отрицательного контроля.

Процедура приготовления образцов отрицательного контроля, испытуемой вакцины и референс-препарата для иммунизации мышей, а также количество животных должны быть описаны в нормативной документации производителя. Животным вводят внутрибрюшинно по 1 мл соответствующего разведения исследуемого препарата, референс-вакцины и отрицательного контроля.

Через 28-30 дней животных обескровливают. Полученные индивидуально от каждого животного сыворотки анализируют на наличие антител методом ИФА с использованием тест-систем для количественного определения антител к поверхностному антигену вируса гепатита В с чувствительностью 5-10 мМЕ/мл в соответствии с инструкцией по применению.

Учет результатов. Вычисляют среднее арифметическое значение оптической плотности сывороток невакцинированной группы животных (отрицательный контроль). Положительными считают сыворотки, показания оптической плотности которых равны или выше среднего арифметического отрицательного контроля плюс коэффициент тест-системы. Для каждой группы мышей вычисляют процент эффективности (показатель сероконверсии (ПСК) в %) по формуле:

Методом пробит-анализа или методом скользящих средних на основании ПСК рассчитывают ЕД₅₀ испытуемой серии вакцины и референс-образца. Находят отношение ЕД₅₀ референс-препарата к ЕД₅₀ испытуемой вакцины.

Полнота сорбции антигена. Количество несвязанного поверхностного антигена вируса гепатита В должно быть не более 1% от номинального количества. Испытуемый образец вакцины в объеме 1000 мкл центрифугируют при 6000 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре, если в частной фармакопейной статье не даны другие указания. В качестве референс-препарата используют несорбированный HBsAg с известной концентрацией. Процедура разведения надосадочной жидкости, референс-препарата и буфер для разведений должны быть валидированы для конкретного препарата каждым производителем.

Определение несвязанного поверхностного антигена в надосадочной жидкости проводят методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем для выявления HBsAg с чувствительностью не ниже 0,1 МЕ/мл по отношению к референс-препарату. Количество несвязанного поверхностного антигена вируса гепатита В определяют по калибровочному графику референс-образца, используя программу "PARALINE" или аналогичную, либо полноту сорбции (X) в процентах рассчитывают по формуле:

,

где: А - среднее значение оптической плотности надосадочной жидкости;

В - среднее значение оптической плотности референс препарата;

 - фактор разведения надосадочной жидкости.

 - фактор разведения референс препарата.

Тиомерсал. От 0,03 до 0,07 мг в 1 мл вакцины и от 0,018 до 0,035 мг в 0,5 мл вакцины. Определение проводят колориметрическим или атомно-абсорбционным методом в соответствии с ОФС "Количественное определение тиомерсала в иммунобиологических лекарственных препаратах".

Алюминия гидроксид. От 0,35 до 0,65 мг в 1 мл и от 0,18 до 0,32 мг в 0,5 мл вакцины. Определение проводят в соответствии с ОФС "Определение ионов алюминия в сорбированных иммунобиологических лекарственных препаратах".

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты". Маркировка вторичной упаковки должна содержать предупредительные надписи: "Перед употреблением встряхивать", "Хранить в не доступном для детей месте", "Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений", "Не замораживать".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С.