Иммуногенность коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин

ОФС.1.7.2.0005.15 Вводится впервые

 

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения иммуногенности коклюшной суспензии и цельноклеточного коклюшного компонента комбинированных вакцин путем сравнения с иммуногенностью референс-препарата коклюшной вакцины, откалиброванного в международных единицах (МE) по соответствующему международному стандартному образцу. Определение проводят на модели экспериментального менингоэнцефалита при внутримозговом введении иммунизированным мышам заражающей дозы тест-штамма Bordetella pertussis 18323 по методу Kendrick.

 

Материалы

 

Животные. Здоровые мыши с массой тела  г чувствительной линии или аутбредные мыши, способные давать адекватный иммунный ответ. Используют мышей одного пола или самцов и самок, равномерно распределенных по группам. В 1 опыте различия массы тела отдельных животных не должны превышать 2 г. Перед проведением испытания за животными проводят наблюдение в течение 3 сут. При гибели более 10% мышей данную партию не используют.

Референс-препараты:

- стандартный образец иммуногенности коклюшной вакцины, калиброванный в ME по соответствующему международному стандартному образцу;

- стандартный образец мутности 10 ME, калиброванный в международных оптических единицах (ME).

Тест-штамм. В. pertussis 18323, хранят в лиофилизированном состоянии. Продолжительность хранения высушенного штамма не должна превышать 10 лет; биологические свойства лиофилизированного тест-штамма проверяют ежегодно.

Среды. Используют среды Борде-Жангу, казеиново-угольный агар (КУА), их модификации или другие среды, адаптированные к коклюшному микробу.

 

Среда Борде-Жангу

 

В 1500 мл воды очищенной последовательно растворяют ингредиенты:

- калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,25 г,

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,75 г,

- калий хлористый - 1,5 г,

- магний сернокислый - 0,075 г,

- натрий хлористый - 7,5 г.

Полученный солевой раствор до внесения следующих ингредиентов должен иметь рН 7,4-7,5.

Затем в солевой раствор вносят:

- фильтрат картофельного отвара - 500 мл,

- агар зарубежных фирм "Дифко" (США) или "Мерк" (Германия) - 60 г.

Среду кипятят до полного растворения агара, устанавливают рН 7,1-7,2, разливают по  мл в стерильные флаконы вместимостью 500 мл и стерилизуют при температуре 110°С в течение 30 мин. Среду Борде-Жангу хранят при температуре от 2 до 8°С не более 3 мес.

 

Фильтрат картофельного отвара

 

В 1 л воды очищенной вносят 0,5 кг очищенного мелко нарезанного картофеля и нагревают до кипения. В момент закипания добавляют 40 мл глицерина и кипятят в закрытой посуде до полного разваривания картофеля в течение 1,0-1,5 ч, Доводят объем водой очищенной до первоначального уровня и процеживают через двухслойную марлевую салфетку. Картофельный отвар используют свежеприготовленным.

Для получения среды Борде-Жангу с 30% крови содержимое флакона нагревают до температуры 50-55°С, вносят 60 мл дефибринированной крови человека, перемешивают и разливают в чашки Петри. Срок хранения среды с кровью - 10 сут при температуре от 2 до 8°С.

Примечание.

Дефибринированную кровь получают на участках заготовки крови, где ее контролируют на отсутствие возбудителей инфекций, которые передаются при гемотрансфузиях, в соответствии с утвержденными уполномоченными органами РФ "Инструкцией по заготовке и консервированию донорской крови" и "Инструкцией по проведению донорского прерывистого плазмафереза". Срок хранения крови не более 2 сут.

 

Среда КУА (казеиново-угольный агар)

 

На 1 л среды добавляют:

- гидролизат казеина -  мл (берется из расчета, чтобы в готовой среде содержание аминного азота составляло от 150 до 160 мг %),

- дрожжевой диализат -  мл,

- калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

- магний хлористый 6-водный - 0,4 г,

- крахмал растворимый - 1,5 г,

- кальций хлористый - 0,01 г или 1% раствор - 1 мл,

- железо сернокислое 7-водное - 0,01 г или 0,5% раствор - 2 мл,

- медь сернокислая 5-водная - 0,005 г или 0,2% раствор - 2 мл,

- цистеин - 0,03 г или 1,5% раствор - 2 мл,

- агар микробиологический - 30,0 г,

- уголь активированный - 2 г.

Содержание хлоридов в среде должно составлять , аминного азота ( мг%); рН среды доводят до 7,0-7,1 с помощью 20% раствора натрия гидроксида.

Среду разливают в матрацы по  мл, пробирки по  мл и флаконы вместимостью 500 мл по  мл, стерилизуют 30 мин при температуре 110°С и хранят при температуре от 2 до 8°С не более 1 мес. Для получения среды с 10% крови содержимое флакона растапливают, охлаждают до температуры 50-55°С, вносят 20 мл дефибринированной крови человека и перемешивают. Срок хранения среды с кровью 10 сут при температуре от 2 до 8°С.

Гидролизат казеина:

- казеин (сухой) - 2000 г,

- хлористоводородная кислота концентрированная - 1000 мл,

- вода очищенная - 500 мл.

Степень расщепления белка - не менее 93%. Аминный азот 850-1000 мг %, общий азот 910-1080 мг %, натрия хлорид 4-6%. Среду стерилизуют 30 мин при температуре 110°С. Среду используют свежеприготовленной (при добавлении 0,5% хлороформа срок хранения 1 год при температуре от 2 до 8°С).

Дрожжевой диализат:

- дрожжи хлебопекарные - 1000 г,

- вода очищенная - 1000 мл,

- хлороформ - 4 мл.

Аминный азот - не менее 0,54 мг/мл. Срок хранения 3 мес при температуре от 2 до 8°С.

1% раствор гидролизата казеина

Гидролизат казеина - 10 мл (аминный азот 8,5-10,0 мг/мл), натрий хлористый - 6,0 г (до концентрации хлоридов 0,6%), вода очищенная - до 1000 мл. С помощью 20% раствора натрия гидроксида рН доводят до . Среду стерилизуют 15 мин при температуре 121°С. Срок хранения 6 мес. Каждую серию гидролизата казеина проверяют на безвредность путем внутримозгового введения 5 мышам по 0,03 мл. Животные должны оставаться живыми и здоровыми в течение 3 сут.

 

Метод исследования иммуногенной активности коклюшной вакцины

 

Мышей распределяют в группы по 18-20 животных в каждой: по 2 группы для испытуемого и референс-препаратов. Одновременно для контроля вирулентности заражающего штамма В. pertussis 18323 (определение  культуры) из этой же партии животных формируют 4 группы по 10 мышей в каждой.

Необходимо соблюдать принцип случайного распределения животных по группам, случайными должны быть и расположение клеток на полках, и порядок введения разрешающей дозы.

 

Иммунизация мышей

 

Готовят по 3 пятикратных разведения испытуемого и референс-препаратов. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида, рН . В интервале используемых разведений каждого образца должна содержаться средняя эффективная доза .

В ампулу с референс-препаратом вносят стерильный растворитель из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалась 1 ME (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 1).

 

Таблица 1 - Пример разведения референс-препарата

 

Разведение	Объем вносимого разведения I референс-препарата, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Разведения референс-препарата (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза - 0,5 мл
				Количество исходного референс-препарата, мл	Количество ME
I	15	0	1:60	0,0167	0,5
II	2,5	10,0	1:300	0,0033	0,1
III	0,5	12,0	1:1500	0,00066	0,02

 

Образец испытуемой вакцины разводят в 14 раз (разведение I). Из разведения I делают 2 последующих пятикратных разведения по схеме (табл. 2). Если полученное в опыте значение  испытуемой вакцины будет больше значений использованных доз, необходимо изменить разведение I (например, 1:10). Последующие 2 разведения делают по вышеприведенной схеме.

Приготовленные разведения вакцины и референс-препарата хранят при температуре от 2 до 8°С и используют в течение не более 4 ч.

 

Таблица 2 - Пример разведения испытуемой вакцины

 

Разведение	Объем вносимого I разведения вакцины, мл	Объем вносимого растворителя, мл	Кратность разведений исходной вакцины (в 0,5 мл)	Иммунизирующая доза в объеме 0,5 мл
				Количество исходной вакцины, мл	Количество ME (предполагаемое содержание)
I	14	0	1:28	0,0357	0,5
II	2,5	10,0	1:140	0,0071	0,1
III	0,5	12.0	1:700	0,00142	0,02

 

Каждой мыши в каждой группе внутрибрюшинно вводят по 0,5 мл одного из разведений испытуемой вакцины или референс-препарата. К моменту введения заражающей дозы не менее 94% иммунизированных мышей должно остаться в живых и без признаков заболевания. Если гибель животных превышает указанную величину, то опыт не подлежит учету.

 

Приготовление заражающей суспензии тест-штамма В. pertussis 18323

 

Бактериальную суспензию В. pertussis 18323, используемую для заражения, готовят из 20-24-часовой культуры второго-третьего пассажа, выращенной на среде Борде-Жангу, с кровью человека или КУА с кровью человека или на других, адаптированных к коклюшному микробу средах.

Выросшую культуру контролируют путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. Микробные клетки В. pertussis 18323 должны быть морфологически однородны. Посторонняя микрофлора должна отсутствовать.

Готовят бактериальную суспензию микробных клеток с концентрацией, соответствующей 10 ME по стандартному образцу мутности (разведение ). Все дальнейшие разведения микробной суспензии делают в 1% растворе гидролизата казеина, содержащего 0,6% раствор натрия хлорида, рН .

Полученную суспензию разводят последовательно так, чтобы получить заражающую дозу, содержащую 100000 микробных клеток (рабочая суспензия) в объеме 0,03 мл (100-1000 ). Из рабочей суспензии готовят разведения 1/10, 1/50, 1/250 и 1/1250 для определения  тест-штамма и проверки жизнеспособности микробов в суспензии (табл. 3).

 

Таблица 3 - Пример разведения тест-штамма В. pertussis 18323

 

Номер пробирки	Кратность разведения	Объем переносимой суспензии из предыдущей пробирки в последующую, мл	Объем внесенного растворителя, мл	Полученная суспензия содержит в 0,03 мл (эквивалентно)	Назначение
1		1	2	100 млн
2		0,5	4,5	10 млн
3		0,5	4,5	1 млн
4		2	18	100000	Разливают в 3 пробирки для заражения - рабочая суспензия
5		0,5	4,5	10000	Для определения  штамма
6		1,0	4,0	2000
7		1,0	4,0	400
8		1,0	4,0	80

 

Из пробирки 8 сразу после приготовления разведения делают посев по 0,1 мл на 3 чашки Петри со средой Борде-Жангу или КУА с кровью с целью подсчета количества содержащихся в ней живых клеток, выраженного в колониеобразующих единицах (КОЕ). Культуру помещают в термостат с температурой  на 3-4 сут. Для определения количества КОЕ в 30 мкл проводят подсчёт выросших колоний на 3 чашках и полученное значение делят на 10. В 0,03 мл разведения из пробирки 8 должно быть не более 50 КОЕ.

При разведении и в процессе заражения суспензию хранят в холодной водяной бане (вода со льдом). Продолжительность работы с микробной суспензией не должна превышать 2,5 ч с момента приготовления смыва культуры.

Если в испытании используют высокочувствительную к коклюшным антигенам линию мышей, то заражающую дозу тест-штамма 18323 следует уменьшить до содержания 100-1000  в объеме 0,03 мл.

 

Заражение иммунизированных животных

 

Мышам, иммунизированным испытуемой вакциной и референс-препаратом, через 14-17 сут интрацеребрально вводят по 0,03 мл рабочей суспензии живой культуры тест-штамма В. pertussis 18323 (пробирка 4) путем прокола лобной кости в точке, расположенной в 2 мм от средней линии и на 2 мм выше глаза. Для заражения используют туберкулиновые шприцы с ценой деления 0,01 мл, используя иглу N 27, имеющую короткий срез и муфту; длина свободного конца иглы от края муфты до среза должна составлять от 3 до 4 мм. Для определения величины  разведения заражающей дозы (пробирки 5, 6, 7, 8) вводят контрольным мышам соответствующих групп интрацеребрально по 0,03 мл.

Мышей, погибших в течение 3 сут после заражения, исключают из опыта (неспецифическая гибель); в каждой клетке оставляют по 16 мышей.

За зараженными животными наблюдают 14 сут с ежедневной регистрацией их гибели. В день учета результатов (14-е сут) в число погибших включают также всех парализованных мышей.

Вычисление величины  (табл. 4) культуры тест-штамма производят по формуле Кербера:

 

,

 

где:  - максимальная из испытуемых доз;

 - логарифм кратности разведения (отношение большей дозы к следующей за ней меньшей дозе);

Li - отношение числа животных, погибших при введении данной дозы культуры, к общему числу животных, которым эта доза была введена;

 - сумма значений Li, найденных для всех испытанных доз.

 

Таблица 4 - Пример расчета величины  культуры тест-штамма В. pertussis 18323

 

Доза культуры (число микробных клеток) 0,03 мл	Число зараженных животных	Число погибших (парализованных) из общего числа зараженных животных	Значения Li		Кол-во колоний в заражающей дозе 80 клеток
	10	9/10	0,9	648	23
	10	7/10	0,7
	10	4/10	0,4
80	10	2/10	0,2

 

 микробных клеток.

В заражающей дозе ( микробных клеток) содержится

 

Оценка иммуногенной активности испытуемой вакцины

 

Расчет иммуногенной активности испытуемого препарата проводят по методу Вильсона и Вустера с использованием таблиц Национального института здоровья США (для n = 16) или статистическим методом с помощью программы Probit-analysis. Для проведения расчета в таблице Вильсона-Вустера (табл. 5) по вертикальной оси отмечают величину, равную сумме выживших мышей от всех 3 доз препарата (А), по горизонтальной оси - разницу между числом мышей, выживших от наибольшей и наименьшей доз, взятых в опыт (В). В месте пересечения прямых, проведённых от соответствующих величин А и В, находят  (верхняя цифра) и её стандартные отклонения, выраженные в процентах (нижние цифры). Найденное значение соответствует  для средней иммунизирующей дозы, равной 100 мл. Для определения величины  в опыте, найденную в таблице величину  делят на 100 и умножают на значение средней иммунизирующей дозы в данном опыте. Результаты опыта считают достоверными, если стандартное отклонение средней иммунизирующей дозы не ниже 64% и не выше 157% от найденного значения .

Примеры расчета количества ME в 1 мл по методу Вильсона и Вустера приведены в табл. 6.

 

Таблица 5 - Таблица Вильсона-Вустера

 

Общее число мышей, выжившее на все 3 дозы	41	10,1	14,5
		48-208	66-154
	40	9,4	13,6	17,2				Приложение
		42-236	58-172	71-140
	39	9,4	13,4	17,0	20,3			Таблица Вильсона-Вустера
		38-260	53-187	68-153	76-133
	38	9,5	13,75	17,8	20,75	23,1
		36-276	50-199	62-163	71-142	78-128
	37	10,2	14,5	18,5	21,7	24,3	25,9
		35-288	48-208	59-170	67-148	74-134	80-125
	36	11,3	15,6	19,7	23,1	25,9	28,0	29,0
		34-295	47-213	57-175	65-154	71-140	76-131	61-124
	35	12,3	17,0	21,3	26,1	28,0	29,9	31,4	32,9
		34-296	46-217	56-178	64-157	70-144	74-135	78-128	81-124
	34	14,0	19,0	23,5	27,25	30,4	32,9	34,6	35,7	39,9
		34-294	46-218	55-181	63-160	68-147	73-137	76-131	49-126	81-124
	33	16,5	21,7	26,3	29,9	33,5	35,7	38,1	39,3	40,6
		35-288	46-217	55-181	63-161	67-149	72-140	75-133	78,129	80-125
	32	19,4	25,1	29,4	33,5	36,8	39,3	41,9	43,25	44,0	47,7
		36-279	47-214	55-181	62-162	67-150	71,141	74-134	77-131	79-127	81-124
	31	23,1	29,0	34,0	38,1	41,3	44,0	46,2	47,75	48,5	50,0
		37-268	48-210	56-180	62,162	67-150	70-143	73-136	76-132	78-128	80-125
	30	28,0	34,0	38,7	43,3	46,2	49,25	50,9	52,5	53,5	55,1	59,7	61,7
		39-258	49-205	56-178	62-162	66-151	70-143	73-136	75-134	77-130	79-126	81-123	62-121
	29	34,0	39,9	44,7	49,25	52,5	55,1	56,9	57,8	59,7	60,7	62,75	64,8
		41-244	50-201	57-176	62-181	66-151	70-144	72-139	75-134	77-130	79-126	81-123	82-121
	28	41,9	47,7	52,5	56,0	58,8	61,7	63,7	64,9	65,8	66,9	69,1	71,3
		43-233	50-196	57-174	62-161	66-151	70-144	72-139	75-134	77-131	79-137	81-123	82-121
	27	51,7	56,9	61,7	64,6	66,9	69,1	71,3	72,5	72,5	73,6	74,8	76,41
		43-224	52-192	58-173	63-160	66-151	70-144	72-139	74-135	76-131	79-128	81-123	82-121
	26	64,8	69,1	72,5	74,8	76,1	78,6	79,8	79,8	84,4	84,4	82,4	82,4
		44-217	53-188	58-171	63-160	67-160	70-144	72-139	74-134	76-131	78-128	81-123	82-121
	25	79,8	82,4	86,1	86,5	87,9	87,9	89,25	89,25	89,25	90,8	90,6	90,8
		47-211	54-187	59-170	63-159	67-150	70-144	72-139	74-134	76-131	78-128	81-123	82-121
	24	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
		48-211	54-186	59-170	63-159	67-150	70-144	72-139	74-134	77-131	79-127	81-123	83-120
	23	125,3	121,3	117,5	115,6	113,7	113,7	111,75	111,75	111,75	110,25	110,25	110,25
		47-211	54-187	59-170	63-159	67-150	70-144	72-139	74-134	76-131	78-126	81-123	82-131
	22	154,4	144,8	138,0	133,6	131,5	127,3	125,3	125,3	123,3	123,3	121,3	121,3
		46-217	53-188	58-172	63-160	67-150	70-144	72-139	74-134	76-131	78-128	81-123	82-121
	21	193,3	175,7	162,2	164,4	149,5	144,75	140,2	138,0	138,0	135,8	133,6	131,5
		45,224	52-192	58-173	63-160	66-151	70-144	72-139	74-135	76-131	79-128	81-123	82-121
	20	238,5	209,7	190,3	178,5	170,1	162,2	157,0	154,4	152,0	149,5	144,3	140,5
		43-233	50-196	57-174	62-161	66-151	70-144	72-139	75-134	77-131	79-127	81-123	82-121
	19	294,0	250,3	223,6	203,0	190,3	161,4	175,7	172,8	167,4	164,7	159,5	154,4
		41-244	50-201	57-176	62-181	66-151	70-144	72-139	76-134	77-130	79-126	81-123	82-121
	18	356,6	294,0	258,5	231,0	216,5	203,0	196,5	190,3	187,3	181,4	187,4	162,2
		39-258	49-205	56-178	62-162	66-151	70-143	73-137	75-134	77-130	79-126	81-123	82-121
	17	432,6	345,3	294,0	262,7	242,4	227,5	216,5	209,7	206,3	199,8
		38-268	88-210	56-180	62-162	67-150	70-143	73-136	76-132	78-128	80-125
	16	516,5	399,1	339,8	296,7	271,2	254,6	238,5	231,0	227,5	209,7
		36-279	47-214	55-181	62-162	67-160	71-141	74-134	77-131	79-127	81-124
	15	606,6	461,1	380,3	334,5	298,7	280,4	282,0	254,6	246,3
		35-288	46,217	55-181	62-162	67-149	72-140	75-133	78-130	80-125
	14	712,3	524,6	425,7	366,7	329,1	303,6	289,3	280,1	250,3
		34-294	46-218	56-181	63-160	68-147	73-137	76-131	79-126	81-124
	13	810,4	587,4	468,8	399,25	356,6	334,5	318,75	303,5
		34-296	46-217	56-178	64-157	70-144	74-136	78-128	81-124
	12	908	647,8	508,6	432,6	386,5	358,6	345,3
		34-295	47-213	57-175	65-154	71-140	76-131	81-124
	11	963	690,6	542	464,4	413,3	386,5
		35-285	46-208	59-170	67-148	74-134	80-125
	10	1048	727,3	668-75	484,2	432,6
		36-276	50-199	62-163	71-142	78-128
9	1065	747,9	567,4	402
	38-260	53-187	66-163	76-133
8	1065	736,6	578
	42-236	58-172	71-140
7	999,25	691,25
	48-208	68-153
6	676,5
	57-176
	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16
	Разница выживших от наибольшей и от наименьшей дозы

 

Таблица 6 - Пример расчета иммуногенной активности вакцины

 

Препарат	Доза препарата в 0,5 мл			Количество выживших мышей/общее число зараженных в группе	Величины А/В и  по таблице	(стандартные отклонения в опыте)
	Разведение	Количество исходного препарата, м	Количество ME в иммунизирующей дозе
Референс-препарат	1:60	0,0167	0,5	14/16	27/11 71,3 72-139	0,0023 (0,00327-0,00169)
	1:300	0,0033	0,1	10/16
	1:1500	0,00066	0,02	3/16
Вакцина	1:28	0,0357		13/16	23/11 111,75 72-139	0,0079 (0,011-0,0057)
	1:140	0,0071		8/16
	1:700	0,00142		2/16

 

Средняя иммунизирующая доза референс-препарата, выраженная в мл (0,0033 мл), содержит 0,1 ME (табл. 6). При определении  референс-препарата используют значение средней иммунизирующей дозы, выраженное в ME.

 

 ME,

 

 ME,

 

 ME,

 

 мл,

 

 мл,

 

 мл.

 

Количество ME в 1 мл вакцины определяют по формуле:

 

,

 

 МЕ/мл.

 

Доверительный интервал значения иммуногенноcти (МЕ/мл) препарата рассчитывают по формулам:

 

;

 

,

 

где R - количество ME в 1 мл препарата;

 - нижний предел доверительного интервала;

 - верхний предел доверительного интервала;

К - доверительный коэффициент.

 

,

 

где  для более иммуногенного препарата при избранном уровне существенности различия - 95 или 99%;

, для менее иммуногенного препарата.

Для примера:

.

К = 1,6

Отсюда:

 

; т.е.  МЕ

 

; т.е.  ME

 

Таким образом, в 1 мл вакцины содержится 9,0 ME с доверительным интервалом от 5,6 до 14,4 ME.

Если в первом опыте активность препарата не соответствует установленным требованиям, опыт повторяют. В этом случае при вычислении количества ME в 1,0 мл препарата учитывают результаты всех достоверных опытов (не более 3). Используют расчет средней геометрической (Хгеом.) величины значения по формуле:

 

,

 

где  - произведение усредняемых величин;

n - число определений.

Критерии достоверности теста:

-  референс-препарата и испытуемой вакцины лежит в интервале между наибольшей и наименьшей иммунизирующими дозами;

-  не превышает 1000 микробных клеток;

- заражающая доза микробных клеток содержит не менее 100 и не более 1000 ;

- в 0,03 мл разведения из пробирки 8 содержится не более 50 КОЕ.