-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 29.10.2015 № 771 |
Дата введения в действие: | c 01.01.2016 |
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIII издания |
Раздел: | 1.7.2.2. Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток |
Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
Номер: | ОФС.1.7.2.0002.15 |
Внутр.№: | 959.1 |
Статус: | Действующая статья |
Биологические методы испытания препаратов интерферона с использованием культур клеток |
Настоящая общая фармакопейная статья определяет основные требования к биологическим методам испытаний препаратов интерферона с использованием клеточных культур и распространяется на субстанции и лекарственные формы интерферона человеческого всех типов природного и генно-инженерного происхождения.
Биологические методы с использованием клеточных культур применяют для определения следующих показателей качества препаратов интерферона:
Методы определения специфической активности и подлинности основаны на способности интерферона подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом интерферона (СО). Испытания проводят с использованием соответствующих линий клеток, чувствительных к определенному типу интерферона и к индикаторному вирусу.
Наиболее часто используют следующие комбинации клетка/вирус:
- линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vero, линия клеток карциномы гортани человека Нер-2с, линия клеток фибробластов мыши L-929/вирус энцефаломиокардита мышей (EMCV);
- клетки бычьих почек Madin-Darby MDBK, линия клеток почки африканской зеленой мартышки Vera, линия лимфоидных клеток человека Л-41, линия клеток карциномы легкого человека А-549, линия клеток фибробластов мыши L-929, линия клеток амниона человека WISH/вирус везикулярного стоматита (VSV);
- клетки фибробластов человека/вирус леса Семлики (SFV), вирус Синдбис (virus Sindbis) или иные.
Выбор комбинации "клеточная культура/вирус" основывается на том, какая из них обеспечивает наиболее чувствительный ответ для определяемого типа интерферона.
В качестве СО может быть использован международный стандартный образец активности интерферона соответствующего типа или стандартный образец, откалиброванный в Международных единицах (МЕ) по соответствующему международному стандарту.
Испытания проводят в асептических условиях.
Клетки. Требования к клеточным линиям (общие условия культивирования и пересева клеток, пассаж, на котором клетки проявляют оптимальную эффективность при проведении испытания, допустимый предел жизнеспособности клеток при пересевах и при взятии клеточной суспензии в испытание, процент сформированного монослоя) указывают в нормативной документации.
Испытуемые образцы препарата. Пробоподготовку испытуемых образцов проводят в соответствии с указаниями, приведенными в нормативной документации. Для некоторых лекарственных форм препаратов интерферона (суппозитории, мази, гели и т.д.) при пробоподготовке необходимо экстрагирование активного вещества (интерферона) в раствор, с соблюдением следующих условий: используемые реагенты не должны оказывать токсического действия на культуру клеток в разведениях, необходимых для исследования; использование реагентов для экстрагирования должно быть обоснованным.
Индикаторный вирус. Суспензию индикаторного вируса готовят в соответствии с указаниями в нормативной документации на лекарственное средство, содержащее интерферон. Титр вируса должен быть не менее ТЦД/мл.
К составу питательных сред, предназначенных для культур клеток животных и человека, предъявляют определенные требования. Для приготовления питательных сред обычно используются солевые растворы Эрла и Хенкса. Возможно использование стандартных коммерческих сред для ведения культур клеток: Игла MEM, MEM, DMEM (двойная модификация среды Игла), среды 199 , среды RPMI и др. Для стимуляции роста, прикрепления и деления клеток обычно добавляют 5-10% инактивированной сыворотки коров/крупного рогатого скота. В среду для разведений интерферона добавляют 2-5% сыворотки. Для обеспечения бактериологической стерильности в питательные среды вводят антибиотики: пенициллин (натриевая соль), стрептомицин (хлоркальциевый комплекс) из расчета 100-200 ЕД каждого на 1 мл среды, микостатин (нистатин) из расчета 20-25 ЕД на 1 мл или гентамицин (конечная концентрация 10 мкг/мл). Содержание L-глютамина в питательной среде должно быть около 292 мг/л.
В качестве поддерживающей среды обычно используют питательную среду без сыворотки с добавлением антибиотиков и L-глютамина.
Постоянство рН среды является одним из главных условий культивирования. Другим важным условием культивирования является осмотическое давление. Диапазоны рН и осмоляльности, при которых происходит размножение клеток, узки и варьируют в зависимости от типа клеток.
Оценить количество жизнеспособных клеток возможно при помощи красителей: метиленового синего, кристаллического фиолетового, тиазолинового синего (МТТ), Аламара голубого и других.
Противовирусную активность интерферона определяют путем сравнения защитного действия испытуемого препарата (ИП) с аналогичным действием стандартного образца активности интерферона (СО).
Определение специфической активности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток, полученном при температуре в атмосфере с в лунках 96-луночных плоскодонных культуральных планшетов.
Количество клеток, вносимых в каждую лунку планшета, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя при вышеуказанных условиях культивирования в течение 24-48 ч.
Готовят серию разведений испытуемого препарата в среде для разведений интерферона с содержанием 2-5% сыворотки (на 4 разведения выше и ниже предполагаемого титра активности). Параллельно готовят такие же разведения СО в среде для разведения интерферона. Рабочие разведения ИП и СО должны быть указаны в нормативной документации.
Из лунок планшетов с клеточным монослоем удаляют ростовую среду и вносят приготовленные разведения ИП и соответствующего СО, используя на каждое разведение не менее 4-х лунок с культурой клеток.
Возможно внесение ИП и СО в лунки планшета до внесения культуры клеток. В этом случае клеточный монослой будет формироваться с внесённым интерфероном.
Для контроля дозы индикаторного вируса оставляют 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток - 4 лунки. В эти 20 лунок вносят поддерживающую среду.
96-луночные планшеты с культурой клеток, разведениями ИП и СО инкубируют в течение 24-48 ч при температуре в атмосфере с . Затем в каждую лунку с ИП и соответствующим СО вносят вирусную суспензию, содержащую рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса - 100 . В лунки контроля клеток вносят такой же объем поддерживающей среды.
Определение дозы индикаторного вируса начинают с установления его активности.
Для определения активности вируса-индикатора готовят десятикратные разведения вируса в поддерживающей среде (от до ). Из лунок 96-луночного планшета с клеточным монослоем удаляют ростовую среду. После этого вносят в лунки планшета, используемые для определения дозы вируса, поддерживающую среду в объеме, равном объему испытуемого образца. Затем вносят приготовленные разведения индикаторного вируса (не менее, чем по 4 лунки на каждое разведение) в объеме, равном объему внесенной до этого поддерживающей среды. 96-луночный планшет с разведениями вируса инкубируют в течение 24-48 ч при температуре в атмосфере с . За титр (активность) вируса принимают величину, обратную разведению вируса, при котором клеточный монослой в 50% лунок оказался полностью пораженным цитопатическим действием. Титр вируса выражают в тканевых цитопатических дозах - .
Активность вируса вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:
где: - десятичный логарифм титра вируса;
- десятичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% гибель клеток (+);
d - десятичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);
n - число лунок, приходящееся на каждое разведение вируса (=4);
р - число лунок, давших гибель (+) в разведении, ниже которого произошла 100% гибель клеток, и последующих разведениях.
После установления активности вируса производят подсчёт дозы для последующего внесения в лунки с испытуемым препаратом (100 ).
Одновременно с внесением вируса-индикатора осуществляют контроль взятой дозы вируса на 16-ти лунках с культурой клеток (по 4 лунки на каждое разведение вируса).
Вносят вирус, начиная с разведения, соответствующего 100 , и до разведения, соответствующего 0,1 с коэффициентом разведения равным 10.
Лунки с культурой клеток для оценки состояния монослоя клеток остаются интактными.
После внесения индикаторного вируса в дозе 100 96-луночный планшет инкубируют в течение 24-48 ч при температуре в атмосфере с до появления первых признаков цитопатических изменений в клеточном монослое с индикаторным вирусом в дозе 1 . Монослой в лунках с 0,1 индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.
Учёт активности интерферона осуществляют через 24-48 ч при выполнении следующих условий:
- доза внесённого вируса соответствует 100 ;
- в лунках с клетками и минимальными концентрациями ИП и СО, зараженными индикаторным вирусом, наблюдается практически полный цитопатический эффект (80-100%);
- в лунках с контролем клеток отсутствуют признаки дегенерации.
Учёт активности интерферона осуществляют визуально или инструментально.
Визуальный учет активности интерферона производится микроскопически при 100-кратном увеличении через 24-48 ч после внесения индикаторного вируса. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточная культура в 50% лунок полностью защищена от цитопатического действия вируса.
Титр интерферона вычисляют методом Спирмена-Кербера по формуле:
где: - двоичный логарифм разведения, ниже которого произошла 100% защита (-);
d - двоичный логарифм интервала между разведениями (=1,0);
n - число лунок на каждую дозу (=4);
р - число лунок, давших защиту (-) в разведении, ниже которого произошла 100% защита, и последующих разведениях.
Противовирусную активность интерферона в исследуемом образце в ME вычисляют по формуле:
где: - противовирусная активность СО интерферона в ME;
Инструментальный учет активности интерферона предполагает селективное окрашивание живых клеток, защищенных интерфероном от действия вируса, элюирование красителя, фотометрирование оптической плотности элюата и статистическую обработку результатов с помощью метода параллельных линий.
Как правило, результаты исследования снижения цитопатического эффекта соответствуют сигмоидальному графику доза-ответ: зависимость значений оптической плотности элюата ИП и СО от логарифма их разведения.
При расчете активности интерферона по сигмоидальным кривым ИП и СО должны быть соблюдены следующие условия:
- Измеренные оптические плотности для ИП и СО должны находиться в одном диапазоне оптических единиц, ограниченном значениями оптической плотности, измеренными в лунках контроля клеток и вируса;
- Полученные данные должны отвечать требованиям к параллельности, линейности и величине угла наклона кривых доза-ответ для СО и ИП, указанным в нормативной документации.
Используя линейный участок графика, рассчитывают титр ИП и СО, а затем рассчитывают активность интерферона по формуле:
где: - противовирусная активность СО интерферона в ME;
- титр ИП, то есть разведение ИП, в котором наблюдается 50%-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом;
- титр СО, то есть разведение СО, в котором наблюдается 50%-е поражение клеточного монослоя индикаторным вирусом.
Описание инструментального метода приводят в нормативной документации.
Подлинность препаратов интерферона определяют путем нейтрализации противовирусной активности ИП моно- или поликлональными антителами против соответствующего типа интерферона, предусмотренными в нормативной документации на препарат. Реакцию нейтрализации противовирусной активности ИП проводят в культуре клеток, чувствительных к данному типу интерферона, в присутствии индикаторного вируса.
Определение подлинности препаратов интерферона проводят на монослое культур клеток.
Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночных культуральных планшетов, должно быть достаточным для дальнейшего экспоненциального роста клеточной культуры и образования полноценного монослоя в условиях культивирования при температуре в атмосфере с в течение 24-48 ч.
Готовят рабочие дозы ИП и СО. Для этого их разводят средой для разведения интерферона с содержанием 2-5% сыворотки до одной десятой титра противовирусной активности (раздел "Специфическая активность").
Нейтрализующие антитела разводят средой для разведения до концентраций, указанных в нормативной документации.
Для приготовления нейтрализованной смеси подготовленные разведения антител объединяют в равных объемах с рабочими дозами ИП и СО. Полученную смесь инкубируют при температуре в атмосфере с в течение 1 ч.
Из лунок 96-луночного планшета с монослоем культуры клеток удаляют ростовую среду, вносят в лунки планшета нейтрализованную смесь, не менее чем по 4 лунки на каждое разведение антител.
Нейтрализованную смесь допустимо вносить в лунки 96-луночного планшета как до внесения культуры клеток, так и после него.
Для оценки качества монослоя клеток в процессе постановки реакции нейтрализации (контроль) оставляют не менее 4 лунок, в которые не вносят нейтрализованную смесь. В этих лунках заменяют ростовую среду на поддерживающую.
Для контроля защитного действия интерферона также оставляют по 4 лунки на рабочие разведения СО и ИП без нейтрализующих антител.
Проверяют дозу вируса-индикатора как описано в разделе 1 "Специфическая активность".
Индикаторный вирус в дозе 100 вносят во все лунки 96-луночного планшета, кроме 4 лунок, предназначенных для контроля монослоя клеток.
После внесения индикаторного вируса в лунки с культурой клеток планшеты инкубируют при температуре в атмосфере с до появления первых признаков цитопатических изменений в клетках с индикаторным вирусом в дозе 1 (обычно в течение 24-48 ч). Монослой в лунках с 0,1 индикаторного вируса должен соответствовать состоянию клеток в контрольных лунках.
Учёт результатов осуществляют при выполнении следующих условий:
- доза внесённого вируса соответствует 100 ;
- отсутствуют признаки дегенерации в контроле клеток и в лунках с рабочими разведениями СО и ИП без нейтрализующих антител.
Нейтрализация активности испытуемого образца антиинтерфероновыми антителами в сравнении с СО в аналогичном разведении свидетельствует о том, что в испытуемом образце содержится интерферон соответствующего типа.
Подробное описание проведения реакции нейтрализации приводят в нормативной документации.