Лактосодержащие пробиотики

ОФС.1.7.1.0006.15 Вводится впервые

 

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на группу иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП) - пробиотики, содержащие лактобактерии (далее по тексту "лактосодержащие пробиотики").

Лактосодержащие пробиотики представляют собой биомассу живых бактерий рода Lactobacillus, лиофильно высушенную в защитной среде (сахарозо-желатиновой, сахарозо-желатино-молочной или иной).

Лактосодержащие пробиотики по составу подразделяются на:

- Монокомпонентные, - полученные на основе одного производственного штамма лактобактерии (например, L.plantarum 8P-A3 или L.acidophilus La CH-2);

- Поликомпонентные, - полученные на основе нескольких производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus, принадлежащих к одному виду (например, Lacidophilus 100аш, L.acidophilus NK и L.acidophilus ) или к разным видам (например, L.piantarum и Lacidophilus), или на основе нескольких производственных штаммов бактерий разных родов или семейств (например, Lactobacillus fermentum 90T-C4 и Bifidobacterium bifidum 1), дополняющих или потенцирующих друг друга по ферментативным свойствам, антагонистической активности, продукции биологически активных веществ, механизму действия или другим свойствам.

- Комбинированные, - полученные на основе одного или нескольких производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus, или на основе нескольких производственных штаммов бактерий разных родов или семейств и содержащие, помимо живых микроорганизмов-представителей нормофлоры, другие активные компоненты (например, L.fermentum 90T-C4, В. bifidum 1 и Силимар экстракт сухой или L.rhamnosus, витамины и микроэлементы).

 

Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus

 

Штаммы бактерий рода Lactobacillus, используемые для производства лактосодержащих пробиотиков, депонируют в официальных коллекциях (табл. 1).

 

Таблица 1 - Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus, используемые в производстве лактосодержащих пробиотиков в РФ

 

Название производственного штамма бактерий рода Lactobacillus	Место депонирования, коллекционный номер штамма-депозита
Lacidophilus 100аш	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-3190
Lacidophilus	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-3090
Lacidophilus	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-8957 (В центральной лаборатории ВНИМИ N 22/10)
Lacidophilus	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-8958
Lacidophilus	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-8959
Lacidophilus	Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика, ВКПМ N В-8960
L.plantarum 8P-A3	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), N 900811
Lfermentum 90T-C4	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), N 900812
Lplantarum 7-19 (38)	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), N 790038
Lfermentum 1-20 (39)	Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, Россия (ГКПМ), N 790039

 

Производственные штаммы бактерий рода Lactobacillus проверяют по культуральным, тинкториальным, морфологическим и биохимическим свойствам (табл. 2 и 3), безопасности (in vitro и in vivo) (табл. 4). Определение проводят в соответствии с ОФС "Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков" и ОФС "Безопасность пробиотиков in vivo".

Штаммы ацидофильных лактобацилл среднеустойчивы к колистину, триметоприму, азтреонаму, канамицину, суфадиазину, норфлоксацину. Они чувствительны к антибиотикам группы цефалоспоринов.

 

Таблица 2 - Морфологические, тинкториальные и культуральные свойства производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus

 

Название штамма	Описание морфологических и культуральных свойств
L.acidophilus 100аш L.acidophilus	Факультативные анаэробы, микроаэрофилы растут в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере. Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2-4 и более клеток. Штаммы, применяемые для изготовления препарата, могут находиться в S и R-форме. Размер клеток 18-часовой культуры, выращенной в молоке, составляет 10-20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются метиленовой синью. При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48-72 ч роста штаммы образуют "локонообразные" колонии на поверхности агара и колонии в виде "паучков" в глубине агара. Диаметр колоний - 1-2 мм. Штаммы обладают высокой активностью свертывания молока. При оптимальной для роста температуре и внесении 3-5% посевного материала должны свертывать молоко за 1-12 ч, снижая рН молока до уровня 3,8-4,2.
L.acidophilus Lacidophilus L.acidophilus L.acidophilus	Факультативные анаэробы, микроаэрофилы; растут в присутствии азота и углекислого газа в атмосфере. Грамположительные прямые бесспоровые палочки, располагающиеся поодиночке или в виде цепочек из 2-4 и более клеток или поодиночке. Штаммы, применяемые для изготовления препарата, могут находиться в S- и R-форме. Величина клеток 18-часовой культуры в молоке составляет 10-20 мкм. Клетки равномерно окрашиваются по Граму. При выращивании на агаре с гидролизованным молоком через 48-72 ч роста штаммы образуют "локонообразные" колонии на поверхности агара и колонии в виде "паучков" в глубине агара. Диаметр колоний - 1-2 мм. При культивировании на среде МРС-5 в анаэробных или микроаэрофильных условиях через 48-72 ч штаммы образуют круглые без четких границ колонии.
L.plantarum 8P-A3 L.plantarum 7-19	Факультативные анаэробы, растут в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода. На жидкой среде МРС-1 вырастают в виде равномерной мути и гомогенною белого осадка на дне пробирки; на полужидкой среде МРС-2 образуют изолированные колонии в виде тяжей. На плотной среде МРС-4 образуют выпуклые, непрозрачные, белые колонии
L.fermentum 90T-C4 L.fermentum 1-20	Факультативные анаэробы, растут в атмосфере углекислого газа и азота, а также в присутствии кислорода. На жидкой среде МРС-1 дают равномерное помутнение и образуют гомогенный белый осадок на дне пробирки; на полужидкой среде МРС-2 образуют изолированные колонии в виде тяжей. На плотной среде МРС-4 образуют слабовыпуклые, полупрозрачные, сероватые колонии

 

Таблица 3 - Физиолого-биохимические свойства производственных штаммов бактерий рода Lactobacillus

 

Свойства	Штаммы бактерий рода Lactobacillus
	L.acidophilus 100аш,	L.acidophilus , ,	L.plantarum 8Р-А3, 7-19	L.fermentum 90Т-С4, 1-20
Ферментация:
- глюкоза	+	+	+	+
- лактоза	+	+	+	+
- галактоза	+	+	+	+
- манноза	+	+	+	+
- декстроза	+	+	+	+
- фруктоза	+	+	+	+
- мальтоза	+	+	+	+
- сахароза	+	+	+	+
- целлобиоза	+	+	+	в
- салицин	+	+	+	-
- маннит	-	-	+	-
- рамноза	-	-	-	-
- ксилоза	-	-	в	в
- сорбит	-	-	+	-
- арабиноза	-	-	в	в
- эскулин	+	+	+	-
- меллибиоза	+	в	+	+
- трегалоза	в	в	+	в
- мелецитоза	-	-	в	-
Образование газа из глюкозы	-	-	-	+
Образование кислоты из глюкозы	+	+	+	+
Каталаза	-	-	-	-
Лизоцимная активность			-	+
Оптимальная температура роста, °С
Рост при температуре 61°С	+	+
Рост при температуре 20°С	+	+	+	+
Pocт при температуре 15°С	-	-	+	-
Сквашивание молока	+ L(+)-DL-молочная кислота	+ L(+)-DL-молочная кислота	+	+
Рост в щелочной среде (рН = 8)	+	+
Рост в присутствии 0,4-0,6% растворе фенола	+	+
Рост и присутствии солей желчи (до 20%)	+	+
Рост в 2% растворе NaCl	+	+
Адгезивная активность	-	-	+	+
Активность кислотообразования, °Т	не ниже 230	не ниже 230	не ниже 230	не ниже 230
Антагонистическая активность (зоны задержки роста тест-штаммов, мм)	не менее 20	не менее 20	не менее 20	не менее 20

 

Примечание: "+" положительный тест: "-" отрицательный тест

 

Таблица 4 - Изучение безопасности штаммов бактерий рода Lactobacillus

 

Название микроорганизма (род, штамм)	Безвредность		Вирулентность		Токсичность		Токсигенность
	Вводимая доза,  КОЕ/0,5 мл	Кол-во живых/павших мышей	Вводимая доза,  КОЕ/0,5 мл	Кол-во живых/павших мышей	Вводимая доза,  КОЕ/мл	Кол-во живых/павших мышей	Вводимая доза, мл	Кол- во живых/павших мышей
L.acidophilus 100аш	1	10/0	1	10/0	1	10/0	0,5	10/0
	5	10/0	5	10/0	5	10/0	1,0	10/0
	10	10/0	10	10/0	10	10/0
L.plantarum 8P-A3, 7-19 (38)	1	10/0	1	10/0	1	10/0	0,5	10/0
	5	10/0	5	10/0	5	10/0
	10	10/0	10	10/0	10	10/0	1,0	10/0
L.fermentum 90T-C4, 1-20 (39)	1	10/0	1	10/0	1	10/0	0,5	10/0
	5	10/0	5	10/0	5	10/0
	10	10/0	10	10/0	10	10/0	1,0	10/0

 

Производство

 

Производство лактосодержащих пробиотиков основано на выращивании/культивировании производственного штамма или штаммов бактерий рода Lactobacillus на оптимальной питательной среде в адекватных условиях методом глубинного культивирования с последующей лиофилизацией биомассы в защитной среде.

При производстве лактосодержащих пробиотиков проводят валидацию технологического процесса и методов контроля, которые в соответствии с требованиями правил организации производства и контроля качества лекарственных средств доказывают, что конкретная методика, процесс, оборудование, исходное сырье, деятельность персонала или система действительно приводят к ожидаемым результатам и гарантируют, что лекарственное средство соответствует своему составу, не содержит контаминантов, маркировано надлежащим образом, упаковано и сохраняет свои свойства в течение всего срока годности.

При производстве лактосодержащих пробиотиков особое значение имеет постоянное выполнение на всех этапах производства внутрипроизводственного анализа основных показателей качества для оценки их воспроизводимости и анализа качества готовой продукции при выпуске и в течение всего срока хранения.

Лактосодержащие пробиотики для медицинского применения выпускают в следующих лекарственных формах: лиофилизаты (флаконы), порошки, таблетки, капсулы (пероральные, вагинальные, капсула в капсуле), суппозитории и мази. Показатели качества лекарственного средства оценивают в соответствии с лекарственной формой.

 

Испытания

 

Показатели качества лекарственного средства лекарственных форм лиофилизаты, таблетки и капсулы, порошки, суппозитории и мази оценивают в соответствии с требованиями ОФС "Таблетки" и "Капсулы", "Порошки", "Суппозитории" и "Мази".

Описание. Приводится описание внешнего вида соответствующей лекарственной формы лекарственного средства.

Подлинность. Подлинность подтверждают следующими методами - микроскопическим (окраской мазков по Граму), бактериологическим (описание вида колоний, выросших на адекватных питательных средах, и подтверждается специфической активностью). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков", если в нормативной документации не указаны другие требования.

Время восстановления препарата (для лиофилизатов и порошков). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты" либо по методике, описанной в нормативной документации, с указанием времени получения восстановленного препарата (для лиофилизатов - не более 5 мин, для порошков - не более 20 мин, если в нормативной документации нет других указаний).

Время распадаемости (для таблеток и капсул). Испытание проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Указывают применяемый растворитель (среда распадаемости), его объем и, при необходимости, условия растворения (температуру растворителя, перемешивание, встряхивание, использование водяной бани).

Время распадаемости для таблеток не должно превышать 15 мин, для капсул - 20 мин, если в нормативной документации не указаны другие требования.

Температура плавления или время полной деформации (для суппозиториев и мазей). Для суппозиториев, изготовленных на липофильной основе, определяют температуру плавления в соответствии с ОФС "Суппозитории", "Мази" и "Температура плавления" (метод 2), которая не должна превышать температуру 37°С, если нет других указаний в нормативной документации. Если определение температуры плавления затруднительно, то определяют время полной деформации.

Для суппозиториев на липофильной основе определяют время полной деформации в соответствии с ОФС "Определение времени полной деформации суппозиториев на липофильной основе". Время полной деформации не должно превышать 20 мин, если нет других указаний в нормативной документации.

рН (для лиофилизатов, порошков, капсул, таблеток). Испытание проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС "Ионометрия". Указывается допустимый интервал значений рН; в случае определения рН после растворения следует указать растворитель и его объем.

Потеря в массе при высушивании (для лиофилизатов, капсул, таблеток). Определение проводят гравиметрическим методом в соответствии с ОФС "Потеря в массе при высушивании" или другим валидированным методом.

Показатель потери в массе при высушивании должен составлять (если нет других указаний в нормативной документации) для:

- лиофилизатов - не более 3,5%;

- капсул - не более 3,5%;

- таблеток - не более 4,5%;

- порошков - не более 5,0%.

Средняя масса и отклонения от средней массы (для порошков, таблеток, содержимого капсул, суппозиториев и мазей). Приводятся требования к средней массе и максимально допустимые отклонения от средней массы в соответствии с ОФС "Однородность массы дозированных лекарственных форм".

Специфическая безвредность. Определение проводят в соответствии с ОФС "Безопасность пробиотиков в тестах in vivo". Указываются требования и критерии специфической безвредности; требования к животным, используемым для контроля (порода/линия, пол), их количество, групповая масса животных перед введением препарата и после окончания срока наблюдения; дозы, условия разведения и методы введения лекарственного средства; продолжительность наблюдения и учитываемые показатели. Лекарственное средство должно быть безвредным.

Отсутствие посторонних микроорганизмов и грибов (микробиологическая чистота). Определение возможной контаминации испытуемого препарата проводят в соответствии с ОФС "Микробиологическая чистота" методом прямого посева. Лактосодержащие пробиотики должны соответствовать нормативным требованиям, изложенным в ОФС "Микробиологическая чистота" (если в нормативной документации не приведены другие требования):

- категории 5.3.А (лиофилизаты, порошки);

- категории 5.3.Б (таблетки, капсулы, суппозитории, мази*).

* Дополнительно для лекарственной формы мази: в единице препарата (г) должны отсутствовать представители рода Bacillus.

В нормативных документах на пробиотики для детей введены более строгие нормы, а именно:

- для детей (от 3 мес до 1 года) для приема внутрь (таблетки, капсулы и др.), ректально (суппозитории) - не более 10 аэробных бактерий в 1 единице препарата/г; при отсутствии в 1 единице препарата энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, дрожжевых и плесневых грибов;

- для детей (от 1 года) для приема внутрь (таблетки, капсулы), ректально (суппозитории) - не более 50 аэробных бактерий в 1 г препарата; при отсутствии в 1 единице препарата энтеробактерий, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, дрожжевых и плесневых грибов.

Указывают используемые питательные среды, количество и объем испытуемого материала, условия инкубации и ее продолжительность, особенности учета результатов.

Специфическая активность. Специфическая активность определяется количеством жизнеспособных бактерий в 1 дозе лекарственного средства и активностью кислотообразования (или антагонистической активностью) в соответствии с ОФС "Определение специфической активности пробиотиков".

В 1 дозе (таблетке, капсуле и т.д.) препарата должно содержаться:

- лактобактерий вида L.acidophilus - не менее  КОЕ;

- лактобактерий вида L.plantarum не менее  КОЕ.

Активность кислотообразования штамма-продуцента, входящего в испытуемый препарат, должна быть не менее 220°Т (если нет других указаний в нормативной документации).

Производственные штаммы и штаммы для контроля. Определение проводят в соответствии с ОФС "Производственные пробиотические штаммы и штаммы для контроля пробиотиков".

В разделе должна содержаться информация:

1. Наименование производственных штаммов и штаммов для контроля, обоснование для включения в производство (депонирование в официальных коллекциях).

2. Производственные штаммы и штаммы для контроля должны быть проверены на отсутствие контаминации и соответствующим образом охарактеризованы по биологическим и биохимическим свойствам.

Контроль качества производственных пробиотических штаммов и штаммов для контроля пробиотиков рекомендуется проводить не реже 1 раза в год, если в нормативной документации нет других указаний.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8°С, если нет других указаний в нормативной документации. Указывают условия транспортирования и хранения, обеспечивающие стабильность лекарственного средства.