-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Утверждена приказом: | Приказ Минздрава России от 29.10.2015 № 771 |
Дата введения в действие: | c 01.01.2016 |
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XIII издания |
Раздел: | 1.2.4.7. Испытание на гистамин |
Тип: | Общая фармакопейная статья (ОФС) |
Номер: | ОФС.1.2.4.0007.15 |
Внутр.№: | 784.1 |
Статус: | Действующая статья |
Настоящая статья распространяется на определение содержания гистамина in vitro в лекарственных средствах для парентерального применения.
В опыт берут морскую свинку-самца массой тела 200-350 г. За 24 ч до эксперимента животное лишают пищи, но оставляют свободный доступ к воде. После эвтаназии у свинки вскрывают брюшную полость от лонного сочленения до грудины и находят слепую кишку. Место её перехода в ободочную кишку является ориентиром при поиске подвздошной кишки, которая отходит от слепой за 1-2 см до этого участка.
Для того чтобы извлечь подвздошную кишку, тупым зажимом или пинцетом плотно захватывают её основание и отрезают ножницами. Отсечённый конец кишки слегка приподнимают, а затем без натяжения и, не перехватывая её, отсекают ткань брыжейки маленькими разрезами при помощи тупоконечных ножниц. Остатки брыжейки удалять не следует. Все манипуляции с подвздошной кишкой следует проводить осторожно, не растягивая её. Для эксперимента пригоден дистальный участок подвздошной кишки, исключая 10-15 см, ближайшие к слепой кишке.
Подвздошную кишку нарезают на равные части (около 6 см каждая) и помещают в чашку Петри с гипокальциевым раствором Тироде (примечание 1). Этим раствором осторожно промывают полученные отрезки с помощью шприца или резиновой груши с пастеровской пипеткой с затупленным концом до полного удаления содержимого кишечника. Промытые отрезки подвздошной кишки помещают в чистый гипокальциевый раствор Тироде. Они могут быть использованы сразу или храниться в течение 24 ч при температуре от 2 до 4°С (примечание 2).
Непосредственно перед экспериментом промытый отрезок кишки разрезают до длины, требуемой условиями эксперимента (10 мм при использовании электронного датчика или 20 мм при использовании механическою рычага и кимографа).
В качестве СО используют гистамина дигидрохлорид в 3 разведениях: разведение 1( г/мл); разведение 2( г/мл) и разведение 3( г/мл), вызывающие 50,75 и 100% сокращение кишки соответственно. В качестве растворителя используют 0,9% раствор натрия хлорида.
2. Разведение испытуемого образца (ИО)
Испытанию подвергают неразведенный ИО, когда максимально допустимая нормативной документацией концентрация гистамина в неразведенном препарате находится в диапазоне от г/мл до г/мл. При необходимости ИО разводят 0,9% раствором натрия хлорида таким образом, чтобы предполагаемая концентрация гистамина дигидрохлорида в разведении ИО составляла г/мл.
Для регистрации сокращений изолированного отрезка подвздошной кишки морской свинки в изотонических условиях в ответ на введение СО и ИО используют регистрирующую систему, состоящую из термостатируемой ванночки с гипокальциевым раствором Тироде при температуре 35°С, а также электронного датчика с самописцем или механического рычага с кимографом. Ванночку аэрируют карбогеном (95% и 5% ) или воздухом. Нагрузка обычно составляет 500-800 мг. В случае использования механического рычага для вычисления нагрузки следует применять правило равновесия:
Изолированный отрезок подвздошный кишки помещают в ванночку и прикрепляют к регистрирующей системе с помощью лигатуры по диагонали за противоположные концы: один - к крючку на дне ванночки, а другой - к датчику или рычагу. Прикладывают к отрезку нагрузку и оставляют его в покое на 30 мин. За это время необходимо не менее 3 раз сменить в ванночке раствор Тироде.
В термостатируемую ванночку вводят СО в разведении 3 в объёме, равном 1/100 от её ёмкости. Через 30 с (время экспозиции) ванночку промывают тройным объёмом раствора Тироде. После первого отмывания проводят второе таким же объёмом раствора. Ме менее чем через 4 мин после первого введения снова повторяют цикл "введение-экспозиция-два отмывания". Эти циклы повторяют до тех пор, пока не получат не менее 2 одинаковых пиков. Их высоту принимают за 100% (примечание 3). Временные интервалы между введениями испытуемого вещества и между двумя отмываниями должны быть постоянными.
2.0. Предварительное испытание
После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение СО в разведении 3 проводят испытание ИО на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин однократно в случайном порядке вводят СО в разведениях 1 и 3 и неразведенный ИО. Циклы "введение-экспозиция-два отмывания" такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.
В случае, если пик, полученный в ответ на введение ИО, по высоте не меньше, чем пик СО в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИО (см. п. 2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИО, меньше пика СО в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (см. п. 2.2).
2.1. Количественное испытание ИО на гистамин
В случайном порядке поочерёдно вводят СО в разведениях 1 и 3 и ИО до получения не менее 4 пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на введение СО от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют концентрацию гистамина в том разведении ИО, которому соответствует средняя высота его пика, и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведенном ИО.
ИО считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое, указанное в нормативной документации (коэффициент пересчёта гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).
Схема проведения контрольного испытания такая же, как и при количественном определении содержания гистамина в ИО, только вместо ИО используют СО в разведении 2. Если средняя высота его пика соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном разведении ( г/мл), то результаты опыта следует признать достоверными.
Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих случаев:
1. Если средняя высота пика СО в разведении 2 не соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном разведении ( г/мл).
2. Если при количественном определении содержания гистамина в ИО отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИО.
3. Если в процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4).
В каждом из этих 3 случаев следует провести испытание ИО на вещества депрессорного действия в соответствии с ОФС "Испытание на депрессорные вещества".
В мерном цилиндре вместимостью 1 л растворяют в воде очищенной навески NaCl, и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объём раствора тем же растворителем до метки, перемешивают и переливают содержимое цилиндра в 10-литровую стеклянную емкость с притёртой пробкой или полиэтиленовый сосуд того же объема с завинчивающейся крышкой.
Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды очищенной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:
Затем доливают воду очищенную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.
Полученный раствор может храниться при температуре от 3 до 5°С не более 24 ч. Помутнение недопустимо.
Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать водой очищенной. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.
2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед использованием в опыте отрезки следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин держат при комнатной температуре, а затем в течение 20 мин при температуре 35°С в термостате. После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается лёгкими поглаживающими движениями в продольном направлении,
3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причём направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.
Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.
4. Каждую серию, состоящую не менее чем из 4 пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять с помощью теста Нойманна на дрейф:
х - высота пика на введение одного и того же раствора;
n - число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора.
Значение D при Р = 95% должно быть: при n = 4 - меньше 0,78;