Определение содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах микробиологическим методом

ОФС.1.2.4.0012.15   Вводится впервые

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод микробиологического определения количественного содержания витаминов в многокомпонентных лекарственных препаратах. Его осуществляют чашечным или пробирочным методами с использованием указанных ниже тест-штаммов микроорганизмов.

 

Определение количественного содержания витаминов чашечным методом

 

Тест-штаммы микроорганизмов. Для определения содержания цианокобаламина  используют штамм Escherichia coli 113-3 (АТСС 11105).

 

Выполнение испытания

 

Точную навеску порошка растертых драже или таблеток испытуемого препарата, указанную в соответствующих фармакопейных статьях. количественно переносят в мерную колбу определенной вместимости. доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют. Из полученного раствора готовят разведение 1% раствором натрия цитрата(a) так, чтобы концентрация раствора для испытания была близкой к контрольной концентрации раствора стандартного образца (СО) цианокобаламина - 0,05 мкг/мл.

В чашки Петри (6 чашек для построения стандартной кривой и 3 чашки для раствора испытуемого препарата) одинакового диаметра с ровным и плоским дном, установленные на строго горизонтальной поверхности (регулируют по ватерпасу), разливают по 10-12 мл расплавленной и охлажденной до температуры 48-50°С основной среды, засеянной суспензией Escherichia coli 113-3 из расчета от 4 до 6 мл суспензии на 200 мл основной среды. После застывания среды в каждой чашке стерильным бором по трафарету делают лунки в агаре: 6 лунок диаметром 8 мм под углом 60° друг к другу.

В 3 лунки (через одну) каждой из 6 чашек, используемых для построения стандартной кривой, и 3 чашек - для раствора испытуемого препарата, вносят по 0,1 мл раствора СО контрольной концентрации (0,05 мкг/мл). В 3 лунки (через одну) каждой из 3 чашек препарата вносят по 0,1 мл одной из концентраций остальных растворов СО, а также раствора испытуемого препарата. Чашки инкубируют при температуре 37°С в течение 16-18 ч.

По окончании инкубации измеряют диаметры зон стимуляции роста тест-микроорганизма для каждой концентрации растворов СО. После измерения зон роста для всех концентраций рассчитывают среднюю величину зоны, учитывая в каждом случае 3 чашки, т.е. 9 зон. Затем рассчитывают среднюю величину зоны для контрольной концентрации, учитывая все чашки (27 зон).

По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации раствора (0,05 мкг/мл), рассчитанной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации раствора СО, полученной из 3 чашек с каждой отдельной концентрацией, находят поправку к величине зоны данной концентрации. Найденную поправку прибавляют к средней величине зоны данной концентрации, если она положительная, и вычитают, если она отрицательная. Аналогичным образом делают поправку к концентрации раствора испытуемого препарата.

Содержание цианокобаламина в 1 драже или 1 таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

 

 

где: С - содержание цианокобаламина в 1 мл испытуемого раствора, найденное по стандартной кривой, мкг;

К коэффициент разведения;

а - навеска препарата в граммах или количество таблеток;

б - средняя масса одной таблетки, г;

 - коэффициент для пересчета в граммы.

Построение стандартной (калибровочной) кривой. По исправленным значениям величин зон стимуляции роста при добавлении приготовленных концентраций и средней величине зоны контрольной концентрации на всех чашках строят стандартную кривую, откладывая на оси абсцисс концентрации цианокобаламина в мкг/мл, а на оси ординат соответствующие им величины диаметров зон роста. По полученным точкам строят стандартную кривую, находят концентрацию цианокобаламина в мкг/мл и вычисляют его содержание в образце.

 

Примечания.

1. Приготовление основного раствора СО цианокобаламина 100 мкг/мл. В мерной колбе вместимостью 250 мл в 25% спирте растворяют 0,0250 г СО цианокобаламина (в пересчете на сухое вещество), доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. Раствор годен к использованию в течение 2 мес при температуре 2-8°С во флаконе темного стекла с притертой пробкой.

2. Приготовление рабочего раствора СО цианокобаламина 1 мкг/мл. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,0 мл основного раствора СО цианокобаламина и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Раствор годен в течение 5 сут при температуре 2-8°С.

Растворы, содержащие цианокобаламин, не должны подвергаться воздействию прямых солнечных лучей.

Из рабочего раствора СО цианокобаламина в день исследования готовят растворы, содержащие 0,025; 0,050 и 0,075 мкг цианокобаламина в 1 мл. Для этого соответственно 2,5; 5,0 и 7,5 мл рабочего раствора СО помещают в мерные колбы вместимостью 100 мл, доводят объемы растворов в колбах 1% раствором натрия цитрата до метки и перемешивают.

Раствор, содержащий 0,05 мкг цианокобаламина в 1 мл, принимают за раствор СО контрольной концентрации.

3. Хранение и подготовка тест-культуры для анализа. Культуру тест-микроорганизма выращивают на скошенной агаризованной среде при температуре  в течение 16-18 ч. Тест-культуру хранят при температуре 2-8 °С, пересевая не реже одного раза в месяц.

 

	Состав среды для хранения тест-микроорганизма:
-	казеиновый кислотный гидролизат 10%	6 мл(б)
-	калия фосфат двузамещенный	0,02 г
-	железа сульфат	0,0005 г
-	магния сульфат	0,02 г
-	L-аспарагин	0,02 г
-	глицерин	0,2 г
-	агар микробиологический	1,5 г
-	цианокобаламин	10 мкг
-	вода очищенная	до 100 мл
	рН среды до стерилизации

 

Приготовление среды. Ингредиенты (гидролизат казеина и соли) последовательно растворяют в воде. Аспарагин растворяют отдельно в 10 мл воды с добавлением 2 капель 1 М раствора хлористоводородной кислоты при слабом нагревании и добавляют к раствору солей. Устанавливают рН 7,0 полученной смеси 15% раствором натрия гидроксида, после чего доводят объем среды водой очищенной до 100 мл, прибавляют 0,2 г глицерина и 1,5 г агара микробиологического. Смесь нагревают на водяной бане до полного растворения агара, затем прибавляют 10 мкг цианокобаламина.

За 1 сут до проведения испытания тест-микроорганизм пересевают на пептонно-солевую среду следующего состава:

 

А) Пептонно-солевая среда агаризованная:
-	пептон ферментативный сухой	2,0 г
-	натрия хлорид	0,5 г
-	агар микробиологический	1,8 г
-	вода очищенная	до 100 мл
Б) Пептонно-солевая среда жидкая:
-	пептон ферментативный сухой	2,0 г
-	натрия хлорид	0,5 г
-	вода очищенная	до 100 мл
	рН среды до стерилизации .

 

Приготовление сред. Жидкую и агаризованную среды разливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 15 мин. Для получения скошенного агара среду охлаждают в наклонном положении. На обе среды делают посев тест-культуры Е. coli из рабочего музея и инкубируют в течение 16-18 ч при температуре  и используют для приготовления посевного материала.

4. Состав и приготовление основной среды.

 

	Состав основной среды:
-	аммония хлорид	2,0 г
-	натрия хлорид	3,0 г
-	калия фосфат двузамещенный	0,4 г
-	натрия цитрат трехзамещенный	3,0 г
-	лактоза	3,0 г
-	агар микробиологический	15,0 г
-	вода очищенная	до 1000 мл
	рН среды до стерилизации

 

Приготовление среды. Среду разливают по 200 мл в колбы и стерилизуют насыщенным водяным паром при температуре 120-121°С в течение 15 мин. Хранят при температуре 2-8°С не более 2 мес.

Перед розливом в чашки Петри на каждые 200 мл расплавленной среды добавляют по 5 мл стерильного 40% раствора глюкозы. Раствор глюкозы стерилизуют при температуре 120-121°С в течение 10 мин.

5. Приготовление посевного материала. Со скошенного пентонно-солевого агара (А) делают смыв суточной тест-культуры 0,9% раствором натрия хлорида или используют бульонную культуру с жидкой питательной среды (Б). Плотность микробной взвеси должна быть (1-2)  КОЕ/мл.

Вся работа должна выполняться в асептических условиях. В работе используют только химически чистую лабораторную посуду.

 

Определение содержания витаминов пробирочным методом

 

Пробирочный метод используют для определения количественного содержания D-биотина , кальция пантотената , фолиевой кислоты , никотиновой кислоты (или никотинамида) в многокомпонентных препаратах.

 

Тест-штаммы микроорганизмов

 

- Lactobacillus plantarum BKM B-578 (ATCC 8014) используют для определения D-биотина, кальция пантотената и кислоты никотиновой (или никотинамида);

- Enteroccocus faecalis (Е. faecium) BKM B-602 применяют для определения фолиевой кислоты.

 

Выполнение испытания

 

Точную навеску порошка растертых драже или таблеток, указанную в соответствующих фармакопейных статьях или в нормативной документации, количественно переносят водой в мерную колбу определенной вместимости, доводят объем раствора водой очищенной до метки, перемешивают и фильтруют (основной раствор).

Готовят растворы рабочих стандартных и испытуемых образцов. Для этого в 2-3 ряда пробирок одинакового размера разливают по 1 мл свежеприготовленной воды очищенной. Образцы в количестве 1 мл с концентрацией D-биотина около 0,002 мкг/мл, кальция пантотената - 0,2 мкг/мл, фолиевой кислоты - 0,004 мкг/мл, никотиновой кислоты (или никотинамида) - 0,32 мкг/мл вносят в первые пробирки соответствующих рядов и делают 6 последовательных разведений в каждом ряду, перемешивая и перенося 1 мл раствора в следующие пробирки ряда; из последней отбирают 1 мл и удаляют в дезинфицирующий раствор. Затем во все пробирки добавляют по 1 мл основной среды. При этом общий объем полученных растворов в каждой пробирке должен быть равен 2 мл.

В каждом ряду ставят отрицательный контроль, содержащий 1 мл воды очищенной и 1 мл основной среды.

Все пробирки стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 10-15 мин. После охлаждения в каждую пробирку вносят по 0,1 мл разведенной взвеси тест-культуры (п. 5).

Засеянные пробирки инкубируют при температуре  в течение 16-24 ч. Интенсивность роста тест-культуры в пробирках стандартного и испытуемого образцов измеряют на фотометре-нефелометре при длине волны около 540 нм.

Содержание определяемого витамина в одной таблетке в граммах (X) вычисляют по формуле:

 

 

где С - среднеарифметическое содержание D-биотина в 1 мл, найденное по стандартной кривой для шести концентраций растворов испытуемого образца с учетом всех разведений (4; 8; 16; 32; 64 и 128), в мкг;

V, ,  - разведения, мл;

а - навеска испытуемого образца в граммах или количество таблеток;

б - средняя масса одной таблетки, г;

 - коэффициент для пересчета, г.

 

Примечания.

Приготовление рабочих растворов СО витаминов

1. СО D-биотина. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 200 мл 25% спирта, в котором растворяют 0,0010 г D-биотина на кипящей водяной бане. После охлаждения объем раствора доводят тем же растворителем до метки (основной раствор) и перемешивают. В 1 мл основного раствора содержится 2 мкг D-биотина.

В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 5 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,002 мкг D-биотина в 1 мл. Содержание D-биотина в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,0005; 0,00025; 0,000125; 0,0000625; 0,000031; 0,0000156 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.

2. СО кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 50 мл в 25% спирте растворяют 0,050 г кальция пантотената (в пересчете на сухое вещество по содержанию азота) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 1 мг кальция пантотената.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. Переносят 1 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора водой очищенной до метки (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,2 мкг кальция пантотената в 1 мл. Содержание кальция пантотената в стандартном ряду разведении должно соответствовать 0,05; 0,025; 0,0125; 0,00625; 0,0031; 0,00156 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.

3. СО фолиевой кислоты. В мерной колбе вместимостью 100 мл в 5 мл 1% раствора натрия двууглекислого(в) растворяют 0,0100 г фолиевой кислоты, доводят объем водой очищенной до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг фолиевой кислоты.

В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл основного раствора и доводят объём раствора водой очищенной до метки. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл полученного раствора, доводят объём раствора водой очищенной до метки.

10 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл (рабочий раствор). Рабочий раствор содержит 0,004 мкг фолиевой кислоты в 1 мл.

Содержание фолиевой кислоты в стандартном ряду при приготовлении разведений должно соответствовать 0,001; 0,0005; 0,00025, 0,000125; 0,0000625; 0,00003125 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.

4. СО никотиновой кислоты (или никотинамида). В мерной колбе вместимостью 100 мл в 25% спирте растворяют 0,0100 г никотиновой кислоты (или никотинамида) и доводят объем раствора тем же растворителем до метки (основной раствор). В 1 мл основного раствора содержится 100 мкг никотиновой кислоты или никотинамида. Раствор хранят при температуре 2-8°С не более 1 мес.

В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 2 мл основного раствора и доводят объем раствора водой очищенной до метки. 4 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. Рабочий раствор содержит 32 мкг/мл никотиновой кислоты или никотинамида.

Содержание кислоты никотиновой или никотинамида в стандартном ряду разведений должно соответствовать 0,08; 0,04; 0,02; 0,01; 0,005 мкг/мл и 0 мкг/мл - в отрицательном контроле.

Растворы годны к использованию в течение 2-3 мес при хранении в емкости с притертой пробкой при температуре 2-8°С.

 

2. Построение стандартной кривой. На оси абсцисс откладывают содержание определяемого витамина (в мкг/мл) в пробирках стандартного ряда, а на оси ординат - соответствующие им значения процента светопропускания. По полученным точкам вычерчивают стандартную кривую, находят концентрацию соответствующих витаминов в мкг/мл и вычисляют их содержание в образце.

3. Хранение и подготовка тест-культуры для анализа

3.1. L. plantarum ВКМ В-578 (АТСС 8014) поддерживают на питательной среде следующего состава:

 

-	дрожжевой экстракт	2,0 г
-	пептон	0,5 г
-	глюкоза	0,5 г
-	натрия ацетат	0,5 г
-	твин-80	0,01 г
-	агар микробиологический	1,6 г
-	вода очищенная рН	до 100 мл

 

3.2. Е. faecalis ВКМ В-602 поддерживают на питательной среде следующего состава:

 

-	дрожжевой экстракт	1,0 г
-	глюкоза	0,5 г
-	натрия ацетат	0,5 г
-	агар микробиологический	1,8 г
-	вода очищенная	до 100 мл
-	рН .

 

Ингредиенты последовательно растворяют в воде, устанавливают требуемое значение рН 6,8 и доводят объем водой очищенной до 100 мл. Смесь нагревают при перемешивании на кипящей водяной бане до полного растворения агара, разливают по 5 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 10-15 мин, охлаждают в наклонном положении для получения скошенной поверхности агара.

Посевы инкубируют при температуре  в течение 16-24 ч. Тест-культуру хранят при температуре 2-8°С, пересевая не реже одного раза в мес.

 

Примечания.

Состав и приготовление основной среды

 

	1. Состав среды для определения содержания D-биотина:
-	глюкоза	40 г
-	натрия ацетат	20 г
-	раствор гидролизата казеина 10%	100 мл(б)
-	раствор L-цистина и D, L-триптофана	100 мл(г)
-	раствор твина-80	1 мл(д)
-	раствор аденина, гуанина и урацила	10 мл(е)
-	раствор кальция пантотената и тиамина	20 мл(ж)
-	раствор рибофлавина	40 мл(з)
-	раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты	20 мл(и)
-	растворы солей А(л) и солей Б(к)	по 10 мл
-	вода очищенная	до 1000 мл
	рН
	2. Состав среды для определения содержания кальция пантотената:
-	глюкоза	40 г
-	натрия ацетат	20 г
-	раствор гидролизата казеина(б)	100 мл
-	раствор L-цистина и D, L-триптофана(г)	100 мл
-	раствор твина-80(д)	1 мл
-	раствор аденина, гуанина, урацила(д)	20 мл
-	раствор рибофлавина, тиамина, D-битина(м)	20 мл
-	раствор ПАБК, пиридоксина, никотиновой кислоты(и)	20 мл
-	растворы солей А(к) и солей Б(л)	по 20 мл
-	вода очищенная	до 1000 мл
	рН
	3. Состав среды для определения содержания фолиевой кислоты:
-	глюкоза	40 г
-	натрия цитрат(а)	20 г
-	раствор гидролизата казеина(б)	120 мл
-	раствор L-цистина, D,L-триптофана, L-аспарагина(н)	100 мл
-	раствор аденина, гуанина, урацила и ксантина(о)	10 мл
-	раствор тиамина, рибофлавина, никотиновой кислоты(п)	10 мл
-	раствор кальция пантотенатар(р)	8 мл
-	раствор пиридоксина(с)	24 мл
-	раствор ПАБК(т)	10 мл
-	раствор биотина(у)	0,5 мл
-	раствор солей Б*(11)	10 мл
-	вода очищенная	до 1000 мл
	рН .
	4. Состав среды для определения содержания никотиновой кислоты (никотинамида):
-	глюкоза	40 г
-	натрия ацетат	20 г
-	раствор гидролизата казеина(б)	100 мл
-	раствор аденина, гуанина, урацила(е)	10 мл
-	раствор L-цистина и D, L-триптофана(г)	100 мл
-	раствор тиамина и кальция пантотената(ж)	2 мл
-	раствор рибофлавина(з)	8 мл
-	раствор пиридоксина и ПАБК(ф)	2 мл
-	раствор биотина(у)	4 мл
-	растворы солей А(к) и солей Б(л)	по 10 мл
-	вода очищенная	до 1000 мл
	рН

 

5. Приготовление питательных сред для определения содержания витаминов. Глюкозу предварительно обрабатывают углем активированным осветляющим. Для этого к 200 мл 20% раствора глюкозы добавляют 10 г угля, встряхивают в течение 40 мин и фильтруют через плотный бумажный фильтр. К раствору глюкозы добавляют остальные растворы, устанавливают рН 6,8 и доводят объем среды водой очищенной до 1000 мл. Среду нагревают на кипящей водяной бане 5 мин, охлаждают и фильтруют через бумажный фильтр. Готовую среду разливают по 70 мл в колбы вместимостью 100 мл, закрывают и хранят в морозильной камере при температуре минус 18-25°С в течение 3 мес. Перед использованием среду размораживают при комнатной температуре.

 

Приготовление посевного материала

 

Для приготовления посевного материала используют один из нижеприведенных способов:

1) За 1 сут до испытания тест-микроорганизм пересевают на питательную среду соответствующего состава (п. 3) и инкубируют при температуре  в течение 16-24 ч. Клетки отделяют центрифугированием в асептических условиях, надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют в 10 мл стерильного раствора натрия хлорида(х). Вносят 0,05 мл полученной суспензии в 10 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. Мутность используемой суспензии должна быть  по шкале светопропускания фотометра-нефелометра при длине волны около 540 нм.

2) При определении D-биотина, кальция пантотената и никотиновой кислоты (или никотинамида) за 1 сут до испытания небольшое количество исходной тест-культуры L.plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014) пересевают бактериологической петлей на агаризованную среду для лактобактерий (п. 3.1). Инкубируют при температуре  в течение 16-24 ч. После этого культуру смывают стерильным раствором натрия хлорида и доводят содержание микробных клеток до  КОЕ/мл но оптическому стандарту мутности. Затем переносят 0,2 мл взвеси в пробирку с 9,0 мл раствора натрия хлорида, перемешивают и используют в качестве посевного материала для внесения в основную питательную среду (пп. 4.1, 4.2 и 4.4).

Enteroccocus faecalis (faecium) ВКМ В-602 пересевают в жидкую питательную среду следующего состава:

 

-	дрожжевой экстракт	2,0 г
-	пептон	0,5 г
-	глюкоза	0,5 г
-	натрия ацетат	0,5 г
-	твин-80	0,01 г
-	вода очищенная	до 100 мл
	рН .

 

Готовую среду разливают в пробирки по 10 мл и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 10-15 мин.

Последующие этапы работы проводят по той же схеме, что и для L.plantarum ВКМ В-758 (АТСС 8014).

При испытании допускается использование коммерческих сухих стандартных питательных сред известных производителей.

В работе используют только химически чистую лабораторную посуду.

 

______________________________

Примечания.

(а) Приготовление 1% раствора натрия цитрата. В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 10 г натрия цитрата и доводят объем раствора водой до метки. Раствор годен к использованию в течение 7 сут в условиях хранения при температуре 2-8°С.

(б) Приготовление 10% раствора кислотного гидролизата казеина (свободного от витаминов). При приготовлении среды для хранения культуры можно использовать коммерческий сухой солянокислый гидролизат казеина в соответствующем количестве или 10% казеиновый кислотный гидролизат, для которого используют казеин размолотый.

В круглодонной колбе вместимостью 1000 мл смешивают 100 г казеина размолотого с 500 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты(ц). Смесь нагревают с обратным холодильником в течение 24 ч. Первые 5-8 ч растворения казеина нагревание проводят на кипящей водяной бане, затем на электроплитке с асбестовой сеткой. Из полученного гидролизата при пониженном давлении отгоняют хлористоводородную кислоту. К густому остатку прибавляют 300 мл воды очищенной, перемешивают и снова отгоняют до получения густого сиропа. Указанную операцию повторяют дважды. Далее растворяют оставшуюся массу в 100 мл воды, доводят рН раствора до 3,5 с помощью 30% раствора натрия гидроксида и доводят объем раствора водой очищенной до 1000 мл. К готовому раствору прибавляют 20 г угля активированного, встряхивают в течение 1 ч, фильтруют на воронке Бюхнера с отсасыванием. Обработку углем повторяют, получают бесцветный или светло-желтый раствор, который разливают во флаконы по 100 мл, и стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 15 мин. Хранят при температуре 2-8°С.

(в) Приготовление 1% раствора натрия двууглекислого. Растворяют в 100 мл воды очищенной 1 г натрия двууглекислого и хранят при температуре 2-8°С не более 1 нед.

(г) Приготовление раствора L-цистина и D,L-триптофана. В мерной колбе вместимостью 500 мл в 20 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты(ц) растворяют 1 г L-цистина и 1 г D,L-триптофана (или 0,5 г L- триптофана), нагревают до 70-80°С, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем доводят водой очищенной до метки и хранят при температуре 2-8°С.

(д) Приготовление раствора твина-80. Растворяют 2,5 г твина-80 в 25 мл спирта. Хранят при температуре 2-8°С.

(е) Приготовление раствора аденина, гуанина и урацила. По 0,2 г аденина сульфата, гуанина и урацила растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл с добавлением 10 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты(ц) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят объем водой очищенной до метки и хранят при температуре 2-8°С в течение 1 мес.

(ж) Приготовление раствора кальция пантотената и тиамина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг кальция пантотената и 5 мг тиамина хлорида в 25 мл 25% спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и хранят при температуре 2-8°С в течение 2 нед.

(з) Приготовление раствора рибофлавина. В мерной колбе вместимостью 200 мл растворяют 10 мг рибофлавина в небольшом количестве воды с добавлением 1 мл ледяной уксусной кислоты, доводят объем водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2-8°С в течение 2 нед.

(и) Приготовление раствора пара-аминобензойной кислоты (ПАБК), никотиновой кислоты и пиридоксина. Раствор готовят в 25% спирте из расчета, чтобы в 1 мл содержалось 10 мкг ПАБК, 40 мкг никотиновой кислоты и 20 мкг пиридоксина гидрохлорида. Раствор хранят при температуре 2-8°С в течение 2 нед.

(к) Приготовление раствора солей А. Растворяют 5 г калия фосфата однозамещенного и 5 г калия фосфата двузамещенного в 50 мл воды очищенной.

(л) Приготовление раствора солей Б. Растворяют 1 г магния сульфата, 0,05 г натрия хлорида, 0,01 г железа сульфата и 0,05 г марганца сульфата в 50 мл воды очищенной.

Растворы солей А и Б хранят при температуре 2-8°С.

(м) Приготовление раствора рибофлавина, тиамина и D-биотина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 20 мг рибофлавина, 10 мг тиамина хлорида и 4 мг D-биотина в 50 мл раствора 0,02 М уксусной кислоты, объем доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из темного стекла при температуре 2-8°С.

(н) Приготовление раствора L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина. По 1 г L-цистина, D,L-триптофана и L-аспарагина растворяют в 200 мл воде очищенной с добавлением 20 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты(ц) в мерной колбе вместимостью 500 мл, нагревают до 70-80°С, периодически помешивая, до полного растворения аминокислот. После охлаждения объем раствора доводят водой до метки и хранят мри температуре 2-8°С.

(о) Приготовление раствора аденина, гуанина, урацила и ксантина. По 0,1 г аденина сульфата, гуанина хлорида, урацила и ксантина растворяют в воде очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл с добавлением 10 мл 20% раствора хлористоводородной кислоты(ц) при длительном нагревании на кипящей водяной бане. После охлаждения доводят объём водой очищенной до метки и хранят при температуре 2-8°С.

(п) Приготовление раствора тиамина, рибофлавина и никотиновой кислоты (никотинамида). По 10 мг тиамина хлорида, рибофлавина и 30 мг никотиновой кислоты растворяют приблизительно в 150 мл воды очищенной с добавлением 1 мл уксусной кислоты ледяной в мерной колбе вместимостью 250 мл, объём доводят водой очищенной до метки. Хранят в емкости из тёмного стекла при температуре 2-8°С в течение 2 нед.

(р) Приготовление раствора кальция пантотената. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг кальция пантотената в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2-8°С в течение 1 мес.

(с) Приготовление раствора пиридоксина. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 10 мг пиридоксина гидрохлорида в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2-8°С в течение 1 мес.

(т) Приготовление раствора ПАБК. В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 2 мг ПАБК в 25 мл воды очищенной, добавляют 25 мл этилового спирта, доводят водой до метки и перемешивают. Хранят при температуре 2-8°С в течение 1 мес.

(у) Приготовление раствора D-биотина. В мерной колбе вместимостью 500 мл растворяют 1 мг D-биотина при нагревании на кипящей водяной бане в 200 мл воды очищенной с добавлением 2 мл уксусной кислоты ледяной, доводят водой до метки. Хранят при температуре 2-8°С.

(ф) Приготовление раствора пиридоксина и ПАБК. По 10 мг пиридоксина и ПАБК растворяют в 25 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 100 мл, прибавляют 25 мл этилового спирта, доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Хранят при температуре 2-8°С не более 1 мес.

(х) Приготовление раствора натрия хлорида (0,9%) изотонического. Растворяют 2,25 г натрия хлорида в 250 мл воды очищенной, разливают по 10-15 мл в пробирки, стерилизуют насыщенным паром под давлением в паровом стерилизаторе при температуре 120-121°С в течение 15 мин.

(ц) Приготовление 20% раствора хлористоводородной кислоты. Разбавляют 425 мл хлористоводородной кислоты концентрированной (d = 1,19) водой очищенной до 1000 мл и перемешивают.