-
- Главная
- Фармакопея
- ФСО
- Общая информация
Издание: | Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания |
Раздел: | Государственная фармакопея Российской Федерации XV издания |
Связанные ФСО карточки: | |
Тип: | Фармакопейная статья (ФС) |
Внутр.№: | 6606.1 |
Статус: | Проект подготовлен |
Экспертная секция: | Секция стандартизации иммунобиологических лекарственных средств и препаратов крови |
Рассмотрение Фармакопейного комитета: | Одобрено ФК |
Рассмотрение экспертной секцией: | Одобрено экспертной секцией |
Публичное Обсуждение проекта: | Обсуждение завершено |
Обсуждение проекта | закончилось 09.08.2024 |
Вакцина для профилактики гриппа инактивированная представляет собой цельный вирус (вакцина цельновирионная) или смесь антигенов, полученных расщеплением очищенных вирусов гриппа типов А и В одного, двух, трёх или четырёх штаммов, выращенных раздельно в развивающихся куриных эмбрионах (вакцина расщеплённая (сплит-вакцина) и вакцина субъединичная). Вакцина может содержать адъювант и консервант.
Установленное количество антигена (ГА) для каждого штамма, представленного в вакцине, составляет 15 мкг в дозе, если в клинических испытаниях не доказано использование другого количества.
ПРОИЗВОДСТВО (ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ)
Метод производства должен быть валидирован и обеспечивать стабильное получение вакцин, соответствующих требованиям иммуногенности, безопасности и стабильности.
Штаммовый состав вакцин на текущий эпидемический сезон рекомендует Всемирная организация здравоохранения.
Для каждого нового штамма проводят валидацию процесса расщепления вируса в моновалентном препарате сплит-вакцины и подтверждение наличия преимущественного содержания ГА и нейраминидазы в субъединичных моновакцинах.
Для производственных штаммов должна быть задокументирована история пассажей и антигенное соответствие.
Штамм вируса гриппа для получения главной посевной культуры и рабочей посевной культуры должен быть выращен путём заражения в аллантоисную полость развивающихся куриных эмбрионов, полученных от птиц из стад кур, не содержащих определённых патогенов (ОФС «Стада кур для производства и контроля качества вакцин, не содержащие определённых патогенов»). Биомасса вируса гриппа должна быть выращена путём заражения в аллантоисную полость, развивающихся куриных эмбрионов, полученных от птиц из стада здоровых кур или, предпочтительно, от птиц из стада кур, не содержащих определённых патогенов (ОФС «Стада кур для производства и контроля качества вакцин, не содержащие определённых патогенов»). Качество куриных эмбрионов, полученных от птиц из стада здоровых кур, должно быть подтверждено ветеринарным свидетельством, результатами исследований на отсутствие возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной, вирусной этиологии, микоплазменной контаминации, а также соответствовать требованиям общей фармакопейной статьи «Вирусная безопасность».
Производство вакцины основано на системе посевных культур вируса. Из главной посевной культуры готовят рабочую посевную культуру вируса, которая должна быть представлена не более чем пятнадцатью пассажами от соответствующего кандидата в производственный штамм.
Рабочая посевная культура вируса гриппа должна отвечать требованиям ОФС «Испытание на присутствие посторонних агентов в вирусных вакцинах». В посевной культуре вируса гриппа должны быть идентифицированы антигены (ГА и нейраминидазы) подходящим методом.
Определение проводят в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).
Раствор 1. 15,6 г натрия дигидрофосфата дигидрата растворяют в 500 мл воды и доводят объём раствора тем же растворителем до 1000 мл.
Раствор 2. 17,8 г динатрия гидрофосфата дигидрата растворяют в 500 мл воды и доводят объём раствора тем же растворителем до 1000 мл.
280 мл раствора 1 смешивают с 720 мл раствора 2. 100 мл полученного раствора доводят водой до 900 мл, перемешивают. 8,5 г натрия хлорида растворяют в полученном растворе, доводят значение рН до 7,2 раствором 103 г/л хлористоводородной кислоты или раствором 40 г/л натрия гидроксида и доводят водой до 1000 мл.
20,5 г глюкозы, 8,0 г натрия цитрата, 4,2 г натрия хлорида растворяют в 1000 мл воды, фильтруют и доводят значение рН лимонной кислоты раствором 1 М до 5,6. Полученный раствор стерилизуют фильтрацией или автоклавированием в течение трёх последовательных дней при температуре 100 °С и давлении 0,7 атм.
Может быть использован готовый раствор Альсевера.
Допустимо использование иных подходящих антикоагулянтов и консервантов.
Кровь птиц в объёме 1 мл смешивают с 1,2 мл раствора Олсвера (Альсевера). Срок хранения консервированной крови 14 суток при температуре от 2 °C до 8 °С.
Для
приготовления суспензии эритроциты отмывают трижды
4-кратным объёмом (к объёму эритроцитов) буферного раствора, затем осадок
эритроцитов смешивают с соответствующим объёмом буферного раствора.
Определение гемагглютинирующего титра антигена
В лунки круглодонного планшета для серологических реакций (планшет) одного ряда помещают по 50 мкл буферного раствора. В первую лунку прибавляют 50 мкл антигена в разведении 1:10 и выполняют двукратные последовательные разведения, например, до разведения 1:1280, перенося по 50 мкл из лунки в лунку. Из последней лунки удаляют 50 мкл содержимого. Дополнительно в одну лунку этого же планшета помещают 50 мкл буферного раствора (контрольная лунка).
В каждую заполненную лунку прибавляют 50 мкл 0,5 % (об/об) суспензии эритроцитов петуха. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и инкубируют от 40 мин до 45 мин при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контрольной лунке.
В контрольной лунке должна отсутствовать спонтанная агглютинация: эритроциты выпадают в гомогенный с ровными краями осадок на дне лунки.
Реакцию в лунках с антигеном оценивают по «четырёхкрестовой» системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее чётко выраженную агглютинацию эритроцитов (+++ или ++++).
Раствор антигена 8 АЕ (рабочая доза антигена)
Определяют кратность разведения антигена для приготовления его раствора, содержащего 8 АЕ в 25 мкл, делением установленного гемагглютинирующего титра на 16.
Подтверждение рабочей дозы антигена
В шесть лунок планшета, начиная со второй, помещают по 25 мкл буферного раствора. В первые две из них прибавляют по 25 мкл раствора антигена 8 АЕ и перемешивают. Из второй лунки выполняют двукратные последовательные разведения, перенося по 25 мкл из лунки в лунку. Из последней лунки удаляют 25 мкл содержимого.
Дополнительно в одну лунку этого же планшета помещают 25 мкл буферного раствора (контрольная лунка).
Во все лунки прибавляют по 25 мкл буферного раствора и по 50 мкл 0,5 % (об/об) суспензии эритроцитов петуха. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и инкубируют от 40 мин до 45 мин при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контрольной лунке.
Должна наблюдаться агглютинация эритроцитов в первых четырёх лунках планшета, в пятой и шестой лунках агглютинация должна отсутствовать.
В случае отклонения от указанного результата в раствор антигена 8 АЕ добавляют антиген или буферный раствор для получения необходимой рабочей дозы и повторно её подтверждают.
Реакция торможения гемагглютинации
Восстановленные гомологичную и гетерологичные гриппозные сыворотки разводят в 10 раз буферным раствором. В лунки планшета помещают по 25 мкл буферного раствора. В первую лунку одного ряда прибавляют 25 мкл гомологичной сыворотки гриппозной в разведении 1:10 и выполняют шесть (или более) двукратных последовательных разведений, перенося по 25 мкл из лунки в лунку. Из последней лунки удаляют 25 мкл содержимого. В первую лунку другого ряда прибавляют 25 мкл гетерологичной сыворотки гриппозной в разведении 1:10 и выполняют шесть двукратных последовательных разведений, перенося по 25 мкл из лунки в лунку. В каждую заполненную лунку прибавляют по 25 мкл раствора антигена 8 АЕ и инкубируют смесь при комнатной температуре от 30 мин до 60 мин.
Дополнительно в одну лунку этого же планшета помещают 50 мкл буферного раствора (контрольная лунка).
По окончании инкубации в каждую лунку прибавляют по 50 мкл 0,5 % (об/об) суспензии эритроцитов петуха. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и инкубируют от 40 мин до 45 мин при комнатной температуре до оседания эритроцитов в контрольной лунке. За титр сыворотки принимают наибольшее её разведение, вызывающее задержку гемагглютинации в ряду разведений.
Подтверждением подлинности типа и подтипа антигена вируса гриппа является ингибирование гомологичной гриппозной сывороткой. Отношение титра с гомологичной гриппозной сывороткой к титру с каждой из гетерологичных гриппозных сывороток должно составлять не менее 4.
Рабочая посевная культура вируса должна отвечать следующим требованиям.
Инфекционная активность. Определяют инфекционную активность подходящим методом.
Стерильность (ОФС «Стерильность»). Должна выдерживать требования испытания на стерильность.
Микоплазмы (ОФС «Испытание на присутствие микоплазм»). Должна выдерживать требования испытания на микоплазмы. Для определения используют 10 мл от каждой серии.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И СБОР БИОМАССЫ ВИРУСОВ
Биомасса вируса представляет собой первый пассаж от рабочей посевной культуры вируса в аллантоисной полости развивающихся куриных эмбрионов.
После инкубации заражённых развивающихся куриных эмбрионов при подходящей для штамма температуре собирают и объединяют аллантоисные жидкости для получения моновалентного объединённого сбора биомассы вируса. Во время сбора в биомассу вируса может быть добавлен антимикробный агент. Ни на одной стадии не используется пенициллин, стрептомицин. Работа с вирусными штаммами должна проводиться в условиях асептики, в помещениях, исключающих контаминацию.
Должна быть проведена идентификация антигенов вируса гриппа (ГА и нейраминидазы) подходящим методом.
ИНАКТИВАЦИЯ, ОЧИСТКА И РАСЩЕПЛЕНИЕ (ЕСЛИ ПРИМЕНИМО)
Инактивацию и очистку проводят валидированными методами. До или после процесса инактивации моновалентный сбор биомассы вируса концентрируют и очищают высокоскоростным центрифугированием или другим подходящим методом. Вирус гриппа инактивируют методом, эффективность которого была продемонстрирована в рамках одного производства на трёх последовательных сериях. Должно быть доказано, что процесс инактивации вируса сохраняет его антигенные свойства и обеспечивает инактивацию вирусов, в том числе аденовирусов птиц, вируса лейкоза птиц, микоплазм.
В случае использования для инактивации формальдегида, его концентрация на любой стадии инактивации не должна превышать 0,2 г/л; в случае использования бета-пропиолактона – не должна превышать 0,1 % (об/об).
Биомасса инактивированного вируса (моновалентный полупродукт) должна отвечать следующим требованиям:
Антиген гемагглютинина. При отсутствии другого обоснования содержание антигена определяют методом одиночной радиальной иммунодиффузии путём сравнения со стандартным антигеном.
Антиген нейраминидазы. Наличие и тип антигена нейраминидазы подтверждают подходящим ферментативным или иммунологическим методом на первых трёх сборах биомассы вируса для каждого рабочего посевного материала.
Остаточный инфекционный вирус. Инфекционный вирус должен отсутствовать.
Стерильность (ОФС «Стерильность»). Должна выдерживать требования испытания на стерильность. Для определения используют по 10 мл испытуемого образца для каждой среды.
Химические вещества, используемые для инактивации, расщепления (если применимо) и очистки. Допустимое остаточное содержание должно соответствовать установленным нормам. Определение проводят подходящим методом.
Допустимо хранение биомассы инактивированного вируса при температуре от 2 °C до 8 °С.
Чистота. Преимущественное содержание антигенов ГА и нейраминидазы подтверждают методом электрофореза в полиакриламидном геле или другим подходящим методом (если полупродукт применяют для производства субъединичных вакцин).
ГОТОВЫЙ НЕРАСФАСОВАННЫЙ ПРОДУКТ
Готовый нерасфасованный продукт получают смешиванием инактивированных очищенных или инактивированных, расщеплённых и очищенных моновалентных полупродуктов в асептических условиях. Допустимо наличие адъюванта.
Количественное определение может быть проведено до добавления адъюванта.
Антимикробный консервант. Не менее 85 % и не более 115 % от заявленного количества (если готовый нерасфасованный продукт содержит антимикробный консервант). Определение проводят подходящим химическим методом.
Стерильность. (ОФС «Стерильность»). Должен выдерживать требования испытания на стерильность. Для определения используют по 10 мл испытуемого образца для каждой среды.
Готовый нерасфасованный продукт разливают в асептических условиях и укупоривают таким образом, чтобы предотвратить контаминацию. При соответствующем обосновании некоторые испытания, предписанные для проведения на лекарственном препарате, могут быть проведены на готовом нерасфасованном продукте, если доказано, что последующий производственный процесс не влияет на полученный результат.
Определение иммуногенности и реактогенности проводят на первых трёх сериях вакцины, содержащих новый производственный штамм. Каждую серию вакцины исследуют на ограниченной группе (30 человек) серонегативных лиц (с титром антител не более 1:20) или, при соответствующем обосновании, серопозитивных лиц (с титром антител не менее 1:40) в возрасте от 18 лет и старше. Определение титра антител проводят в парных сыворотках (до вакцинации и через 21–28 дней после вакцинации) в РТГА. Титр в РТГА менее 1:10 оценивают, как 1:5.
Лекарственный препарат выдерживает испытание на иммуногенность при его соответствии не менее чем одному из показателей:
- сероконверсия (четырёхкратное и более увеличение титра антител) должна быть более чем у 40 % иммунизированных лиц;
- кратность нарастания титра антител (увеличение среднегеометрического титра антител) должна быть более чем в 2,5 раза;
- защитный (не менее 1:40) титр антител должен быть более чем у 70 % иммунизированных (для серонегативных лиц).
Вакцина должна быть ареактогенной или слабо реактогенной. Допустимые реакции и их количество должно соответствовать установленным по результатам клинических исследований нормам для конкретного лекарственного препарата.
Бесцветная или желтоватая жидкость, прозрачная или опалесцирующая.
Подлинность подтверждают наличием и интенсивностью колец преципитации со стандартной сывороткой (раздел «Количественное определение»). Интенсивность колец преципитации, образованных испытуемым антигеном, должна быть не менее интенсивности колец преципитации, образованных стандартным антигеном ГА при визуальной оценке.
Прозрачность (ОФС «Прозрачность и степень опалесценции (мутности) жидкостей»). Должен соответствовать установленным для конкретного лекарственного препарата требованиям.
Цветность (ОФС «Степень окраски жидкостей», метод 2). Не должен превышать степень окраски эталона сравнения Y5.
Видимые механические включения (ОФС «Видимые механические включения в лекарственных препаратах»). Должны отсутствовать.
рН (ОФС «Ионометрия»). Должен соответствовать установленным для конкретного лекарственного препарата требованиям.
Извлекаемый объём (ОФС «Извлекаемый объём лекарственных форм для парентерального применения»). Не менее номинального.
Общий белок (ОФС «Определение белка»). Не более 100 мкг на дозу для цельновирионных и расщеплённых вакцин для каждого из входящих в состав вакцины штамма. Не более 40 мкг на дозу для субъединичных вакцин за вычетом количественного содержания ГА для каждого из входящих в состав вакцины штамма.
Стерильность (ОФС «Стерильность»). Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на стерильность.
Бактериальные эндотоксины (ОФС «Бактериальные эндотоксины»). Менее 100 МЕ на дозу.
Остаточный инфекционный вирус (специфическая безопасность). Инфекционный вирус должен отсутствовать.
В аллантоисную полость десяти развивающихся куриных эмбрионов (10–12 дневных) инокулируют по 0,2 мл испытуемого образца. Инкубируют развивающиеся куриные эмбрионы в течение 72 ч при подходящей температуре (в соответствии с требованиями к штамму, принимая во внимание максимальную температуру и время инкубации). По окончании инкубации оценивают жизнеспособность эмбрионов. Не менее 8 из 10 эмбрионов должны остаться живыми. Собирают по 0,5 мл аллантоисной жидкости отдельно от каждого эмбриона, объединяют и вносят по 0,2 мл в аллантоисную полость другим десяти развивающимся куриным эмбрионам, инкубируют при тех же условиях и определяют наличие гемагглютининов в аллантоисной жидкости каждого эмбриона с использованием 1 % (об/об) суспензии эритроцитов петухов.
Результаты реакции гемагглютинации должны быть отрицательными. При наличии гемагглютининов в аллантоисной жидкости после 2-го пассажа, допустимо проведение 3-го пассажа. Гемагглютинация должна отсутствовать.
Химические вещества, используемые для расщепления и очистки. Допустимое остаточное содержание должно соответствовать установленным нормам. Определение проводят подходящим методом.
Стабилизатор. Содержание стабилизатора должно соответствовать установленным нормам. Определение проводят подходящим методом.
Адъювант. Содержание адъюванта должно быть в допустимых пределах относительно заявленного количества (если лекарственный препарат содержит адъювант). Определяют подходящим методом.
Антимикробный консервант. Не менее установленного эффективного количества и не более 115 % от заявленного количества (если лекарственный препарат содержит антимикробный консервант). Определяют подходящим химическим методом. Если лекарственный препарат содержит тиомерсал определение проводят по ОФС «Определение тиомерсала в вакцинах и анатоксинах». Содержание тиомерсала должно быть от 42,5 мкг до 57,5 мкг на дозу.
Овальбумин (ОФС «Метод иммуноферментного анализа»). Не более 1 мкг на дозу.
Содержание антигена (ГА) определяют методом одиночной радиальной иммунодиффузии (ОФС «Иммунохимические методы»), сравнивая его со стандартным антигеном ГА.
В качестве стандартного ГА может быть использован фармакопейный стандартный образец, международный стандартный ГА или аналогичный.
Обязательным условием является использование соответствующей стандартной сыворотки к гомологичному антигену. В качестве стандартной сыворотки может быть использован фармакопейный стандартный образец, международная стандартная сыворотка или аналогичная.
Гемагглютинин, диффундируя из лунок агарозного геля в радиальном направлении, реагирует со специфическими антителами сыворотки, находящейся в агарозе, и образует в геле зону преципитации. Размеры окружающей лунку зоны преципитации находятся в прямой зависимости от количества антигена, внесённого в лунку.
В подходящую ёмкость помещают агарозу, прибавляют буферный раствор (раздел «Производство (особенности технологии). Посевные культуры вируса. Идентификация (антиген ГА)»), нагревают на водяной бане до полного растворения, фильтруют и разливают в пробирки.
К 200 мл уксусной кислоты ледяной прибавляют 500 мл этанола, и доводят объём раствора водой до 1000 мл. Раствор хранят не более 6 мес при комнатной температуре в ёмкости с притёртой пробкой.
Испытуемый раствор. Смешивают 0,45 мл испытуемого образца и 0,05 мл раствора подходящего детергента, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Раствор стандартного антигена. Стандартный антиген восстанавливают и при необходимости разводят подходящим растворителем до ожидаемого содержания ГА в испытуемом образце. Смешивают 0,45 мл восстановленного стандартного антигена с 0,05 мл раствора подходящего детергента, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
Агарозу в пробирках расплавляют на водяной бане, затем инкубируют при температуре 56 °С не менее 30 мин. По окончании инкубации в каждую пробирку вносят стандартную сыворотку в количестве, указанном в инструкции по применению, аккуратно перемешивают содержимое пробирок в течение нескольких секунд, не допуская образование пузырьков воздуха, и помещают на пластины размером 6 × 9 см или 6 × 10 см. Инкубируют пластины при комнатной температуре до полного застывания агарозы.
Готовят разведения испытуемого раствора и раствора стандартного антигена в буферном растворе в соотношении 3:1, 1:1 и 1:3. Полученные разведения должны содержать гемагглютинин в количестве, позволяющем получить сопоставимые по диаметру зоны преципитации для испытуемого образца и стандартного антигена.
На пластинах в агарозе пробойником делают 6 или 8 рядов лунок диаметром 3–4 мм (по 4 лунки в каждом ряду). В лунки помещают испытуемый раствор и его разведения, раствор стандартного антигена и его разведения. Инкубируют пластины при комнатной температуре до полного диффундирования растворов, затем – во влажной камере при температуре от 20° С до 25° С в течение 18–24 часов. После инкубации окрашивают пластины подходящим красителем (например, Кумасси бриллиантовым синим R-250), затем обесцвечивают в растворе для обесцвечивания гелей до визуализации колец преципитации на светло-синем фоне.
Измеряют квадраты диаметров колец преципитации в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и рассчитывают среднюю величину по двум рядам для каждого разведения испытуемого раствора и раствора стандартного антигена. Строят графики линейной зависимости квадрата диаметра кольца преципитации от разведения антигена. График для испытуемого образца должен располагаться на расстоянии, не превышающем 3 мм² по оси ординат от графика для стандартного антигена, в противном случае результаты испытания не учитывают и проводят повторное испытание с изменёнными концентрациями испытуемого образца и/или стандартного антигена.
На
оси ординат между первыми точками графика для стандартного антигена и графика
для испытуемого образца находят среднюю точку, от которой проводят линию,
параллельную оси абсцисс (средняя линия). Находят расстояние (по
перпендикуляру) от графика для испытуемого образца на уровне значения квадрата
диаметра кольца преципитации испытуемого раствора до средней линии; находят
расстояние (по
перпендикуляру) от
графика для стандартного антигена на уровне значения квадрата диаметра кольца
преципитации раствора стандартного антигена до средней линии. Количество ГА () в вакцине в мкг/мл вычисляют по
формуле:
При отсутствии другого обоснования используют метод угловых коэффициентов. В этом случае доверительный интервал (р = 0,95) установленного содержания антигена ГА должен составлять не менее 80 % и не более 125 %. Нижняя граница доверительного интервала (р = 0,95) должна составлять не менее 80 % от заявленного содержания антигена ГА.
- вакцина произведена с использованием развивающихся куриных эмбрионов;
- наименование штаммов используемые в производственном процессе;
- содержание антигена ГА, мкг на штамм вируса на дозу;