ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Смесь сульфатов полипептидов, продуцируемых определёнными штаммами Paenibacillus polymyxa, основным компонентом которой является полимиксин B1.

Содержание: не менее 6 500 МЕ/мг в пересчёте на сухую субстанцию.

СВОЙСТВА

Описание. Белый или почти белый порошок.

Гигроскопичен.

Растворимость. Легко растворим в воде, практически нерастворим в этаноле 96%.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Первая идентификация: Б, Г.

Вторая идентификация: А, В, Г.

А. Тонкослойная хроматография (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

Испытуемый раствор. 5 мг испытуемого образца растворяют в 1 мл смеси равных объёмов хлористоводородной кислоты концентрированной и воды. Нагревают при 135 °C в герметичной пробирке в течение 5 ч. Выпаривают досуха на водяной бане и продолжают нагревать до испарения хлористоводородной кислоты. Полученный остаток растворяют в 0,5 мл воды.

Раствор сравнения (а). 20 мг L-лейцина растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл.

Раствор сравнения (б). 20 мг треонина растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл.

Раствор сравнения (в). 20 мг фенилаланина растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл.

Раствор сравнения (г). 20 мг серина растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл.

Условия хроматографирования:

- ТСХ пластинка со слоем силикагеля G;

- подвижная фаза: вода – фенол (25:75 об/об);

- наносимый объём пробы: 5 мкл в виде полос длиной 10 мм на 2 мм, затем пластинку помещают в хроматографическую камеру, чтобы она не соприкасалась с подвижной фазой, и оставляют там на 12 ч;

- высушивание: при температуре 100–105 °С;

- детектирование: опрыскивают нингидрина раствором 1,7 % уксусно-спиртовым и нагревают при 110 °C в течение 5 мин.

Требования: на хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться основная зона адсорбции на уровне основных зон адсорбции на хроматограммах растворов сравнения (а), (б) и (в) соответствующая ей по величине и окраске и отсутствовать на хроматограмме раствора сравнения (г); на хроматограмме испытуемого раствора должна присутствовать зона адсорбции с низким значением фактора замедления (фактор удерживания) R_f (2,4-диаминобутановая кислота).

Б. Жидкостная хроматография. Используют хроматограммы, полученные в испытании «Компонентный состав».

Требование: на хроматограмме испытуемого раствора время удерживания основных пиков полимиксинов B1, B2, B3 и B1-I должно соответствовать времени удерживания основных пиков полимиксинов B1, B2, B3 и B1-I на хроматограмме раствора сравнения (а).

В. Качественная реакция. 2 мг испытуемого образца растворяют в 5 мл воды и прибавляют 5 мл раствора 100 г/л натрия гидроксида. Взбалтывают и по каплям прибавляют 0,25 мл раствора 10 г/л меди(II) сульфата, взбалтывая после каждого прибавления; должно появиться красновато-фиолетовое окрашивание.

Г. Качественная реакция. Испытуемый образец даёт реакцию на сульфаты (ОФС «Общие реакции на подлинность»).

ИСПЫТАНИЯ

pH (ОФС «Ионометрия», метод 3). От 5,0 до 7,0.

0,2 г испытуемого образца растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл.

Компонентный состав. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Смесь растворителей: ацетонитрил – вода (20:80 об/об).

Испытуемый раствор. 50,0 мг испытуемого образца растворяют в смеси растворителей и доводят объём раствора той же смесью растворителей до 100 мл.

Раствор сравнения (а). Содержимое флакона с фармакопейным стандартным образцом полимиксина B сульфата растворяют в 50 мл смеси растворителей.

Раствор сравнения (б). 1 мл раствора сравнения (а) доводят до 100 мл смесью растворителей.

Условия хроматографирования:

- колонка: длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм; заполненная силикагелем октадецилсилильным эндкепированным для хроматографии с размером частиц 5 мкм;

- температура колонки: 30 °С;

- подвижная фаза: смешивают 20 объёмов ацетонитрила и 80 объёмов раствора, приготовленного следующим образом: 4,46 г натрия сульфата безводного растворяют в 900 мл воды для хроматографии, доводят pH до 2,3 фосфорной кислоты раствором 1 М и доводят до 1000 мл водой для хроматографии;

- скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

- детектор: спектрофотометрический; длина волны, 215 нм;

- вводимый объём пробы: по 20 мкл;

- время хроматографирования: должно в 1,4 раза превышать время удерживания полимиксина B1.

Идентификация компонентов: для идентификации пиков компонентов полимиксинов B1, B2, B3 и B1-I используют хроматограмму раствора сравнения (а), хроматограмму, прилагаемую к фармакопейному стандартному образцу полимиксина B сульфата и относительное время удерживания.

Относительное время удерживания (время удерживания полимиксина B1 – около 35 мин): полимиксин B2 – около 0,5; полимиксин B3 – около 0,6; полимиксин B1-I – около 0,8.

Пригодность хроматографической системы:

- разрешение (R_S): не менее 3,0 между пиками компонента полимиксина B2 и компонента полимиксина B3 на хроматограмме раствора сравнения (а);

- отношение сигнал/шум (S/N): не менее 20 для основного пика полимиксина B1 на хроматограмме раствора сравнения (б).

Содержание каждого компонента полимиксина B1, полимиксина B2, полимиксина B3 и полимиксина B1-I в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»).

Пределы содержания компонентов:

- полимиксин B1-I: не более 15,0 %;

- полимиксин B3: не более 6,0 %;

- сумма полимиксинов B1, B2, B3 и B1-I: не менее 80,0 %;

- неучитываемый предел: 0,40 %.

Родственные примеси. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») в условиях, описанных в испытании «Компонентный состав».

Содержание родственных примесей вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»).

Пределы содержания примесей:

- любые примеси: для каждой примеси, не более 3,0 %;

- сумма примесей: не более 17,0 %;

- неучитываемый предел: 0,40 %.

Остаточные органические растворители (ОФС «Остаточные органические растворители»).

Сульфаты. От 15,5 % до 17,5 % в пересчёте на сухую субстанцию.

0,250 г испытуемого образца растворяют в 100 мл воды и при помощи аммиака раствора концентрированного 25 %, доводят значение рН до 11, прибавляют 10,0 мл раствора 24,4 г/л бария хлорида и 0,5 мг фталеинового пурпурного и титруют 0,1 М раствором натрия эдетата, добавляют 50 мл этанола 96 %, когда окраска раствора начнёт изменяться и продолжают титровать до исчезновения фиолетово-синей окраски.

1 мл раствора 24,4 г/л бария хлорида эквивалентен 9,606 мг SO₄.

Потеря в массе при высушивании (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 3). Не более 6,0 %.

1,000 г испытуемого образца высушивают в вакууме при давлении не более 0,7 кПа, при температуре 60 °С в течение 3 ч.

Сульфатная зола (ОФС «Сульфатная зола»). Не более 0,75 %.

Определение проводят с использованием 1,0 г испытуемого образца.

Микробиологическая чистота. Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на микробиологическую чистоту.

Испытание проводят для нестерильных субстанций.

Стерильность (ОФС «Стерильность»). Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на стерильность.

Испытание проводят для стерильных субстанций.

Пирогенность (ОФС «Пирогенность»). Вводят 1,0 мл раствора, содержащего 1,5 мг/мл испытуемого образца в воде для инъекций, на 1 кг массы животного. Если субстанция предназначена для производства лекарственных препаратов для парентерального применения без последующего удаления пирогенов, то испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на пирогенность.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Микробиологический метод (ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков»).

ХРАНЕНИЕ

В плотно укупоренной упаковке, в защищённом от света месте.

Если субстанция стерильная, её хранят в стерильной герметичной упаковке с контролем первого вскрытия.