Определение остаточных белков клетки-хозяина

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.0.0.0000

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

В общей фармакопейной статье приведены рекомендации по выбору метода, разработке и валидации методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина для испытаний лекарственных средств, полученных с использованием технологии рекомбинантной ДНК, что не исключает возможности использования других альтернативных методов.

ВВЕДЕНИЕ

Белки клетки-хозяина представляют собой производственные примеси, источником которых является организм, из которого получены клетки, используемые в производстве лекарственного средства с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Предполагают, что снижение содержания белков клетки-хозяина до минимально возможного уровня уменьшит риск развития побочных эффектов лекарственного препарата (например, иммуногенность).

Необходимо оценить эффективность удаления белков клетки-хозяина в процессе очистки. Содержание белков клетки-хозяина должно быть количественно определено с помощью методики, разработанной и валидированной для конкретного лекарственного средства.

Предел содержания остаточных белков клетки-хозяина, выраженный в нанограммах на миллиграмм действующего (активного) вещества (ppm), должен быть обоснован с учётом эффективности процесса очистки в отношении белков клетки-хозяина и их потенциального влияния на организм пациента, исходя из введения максимального количества остаточных белков клетки-хозяина с дозой лекарственного препарата.

При определении допустимых пределов содержания необходимо учитывать, что невозможно установить общий предел содержания остаточных белков клетки-хозяина для всех конкретных лекарственных препаратов, в связи с тем, что качественные и количественные характеристики остаточных белков клетки-хозяина изменяются от одного продукта к другому и даже от одной процедуры производства (очистки) к другой.

Определение остаточных белков клетки-хозяина, как правило, проводят методами иммуноферментного анализа (ИФА), используя в качестве реактивов специально приготовленный антиген (белки клетки-хозяина) или стандартный образец белков клетки-хозяина и соответствующие поликлональные антитела к широкому спектру белков клетки-хозяина, характерных для конкретного лекарственного средства.

Для определения остаточных белков клетки-хозяина, как правило, используют метод «сэндвич» ИФА. Содержание остаточных белков клетки-хозяина, определяемое с помощью ИФА, не отражает абсолютное массовое содержание примесных белков. Чувствительность реакции обусловлена результатом, наблюдаемым при совокупной ответной реакции на множество отдельных белков клетки-хозяина, в сравнении с ответной реакцией на стандартный образец белка клетки-хозяина. При разработке и выборе метода определения остаточных белков клетки-хозяина для получения характеристик различных белков клетки-хозяина, содержащихся в лекарственном средстве, рекомендуется использовать ортогональные аналитические методы (например, электрофорез, ВЭЖХ, вестерн-блоттинг, масс-спектрометрия).

ВЫБОР МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Существуют различные типы методов количественного определения остаточных белков клетки-хозяина. Метод выбирают с учётом различных факторов, включая стадию разработки лекарственного препарата, природу клетки-хозяина и иммуногенность белков, тип экспрессии, производственный процесс и предшествующий опыт.

При выборе и разработке методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина необходимо учитывать жизненный цикл испытания (обеспеченность реактивами, постоянство их качества, валидацию методики количественного определения, внесение изменений в производственный процесс).

ТИПЫ МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Методику количественного определения остаточных белков клетки-хозяина, специфичных для производственного процесса или специфичных для лекарственных средств разрабатывают и валидируют с учётом особенностей производственного процесса и с использованием той же экспрессирующей системы, что и при производстве лекарственного средства с использованием технологий рекомбинантного ДНК.

Антигены белков клетки-хозяина (целевой белок) получают путём имитации процесса производства фармацевтической субстанции (или аналогичного ему процесса) до стадии, способной вырабатывать широкий спектр белков клетки-хозяина в достаточном количестве.

При получении антисывороток следует учитывать важность направленности антител к наиболее широкому спектру белков клетки-хозяина, чтобы определять как можно больше различных белков клетки-хозяина и учитывать вариабельность производственного процесса.

ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Платформенные методы количественного определения остаточных белков клетки-хозяина разрабатывают производители для конкретных биотехнологических процессов, используемых в производстве.

Одни и те же наборы реактивов применяют для определения остаточных белков клетки-хозяина в нескольких лекарственных средствах, полученных от одного типа экспрессирующей системы (например, линия клеток яичников китайского хомячка (CHO)), при условии, что процессы наработки биологического материала с целевым продуктом (и последующие за ним выделение и очистка целевого продукта, если применимо) достаточно схожи для этих лекарственных средств. Возможность применения антисыворотки должна быть оценена, как описано для процесс-специфичных методов количественного определения.

ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Готовые наборы реактивов для определения остаточных белков клетки-хозяина предназначены для работы с широким спектром белков от аналогичных типов экспрессирующих систем. Подробная информация по производству реактивов может быть недоступна. Например, антигены могут быть выделены из смеси штаммов клетки-хозяина, и используемый процесс (процессы) может не совпадать с процессом, применяемым для конкретного лекарственного средства. Возможность применения антисыворотки должна быть оценена, как описано для процесс-специфичного метода количественного определения.

КРИТЕРИИ ВЫБОРА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Ввиду потенциальных вопросов безопасности, ассоциированных с остаточным количеством белков клетки-хозяина в фармацевтических субстанциях, для выбора между общими, платформенными или процесс-специфичными методами количественного определения проводят оценку риска, принимая во внимание стадию разработки лекарственного средства.

На начальном этапе разработки могут быть использованы общий или платформенный методы количественного определения.

На поздних этапах разработки следует использовать процесс-специфичные методы количественного определения как более точные, особенно в сравнении с общими методами количественного определения, так как процесс-специфичные методы с большей вероятностью позволяет выявить иммунореактивность против характерных белков клетки-хозяина. Методы платформенного или общего количественного определения могут быть использованы при условии, что методика количественного определения соответствующим образом валидирована и её пригодность оценена относительно специфичных для процесса остаточных белков клетки-хозяина.

ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИГЕНОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ

Для иммунологического количественного определения остаточных белков клетки-хозяина реактивы (антигены и антисыворотки) получают способами, которые при необходимости могут быть повторно воспроизведены.

Антигены используют для получения поликлональных антител с помощью иммунизации одного или нескольких подходящих видов животных. Кроме того, антигены белков клетки-хозяина применяют в качестве стандартного образца при количественном определении остаточных белков клетки-хозяина.

Антигены должны охватывать как можно более широкую совокупность видов белков клетки-хозяина, которые могут быть получены в производственном процессе целевого белка и по возможности включать в себя всю совокупность видов белков, получаемых в условиях наихудшего случая процесса очистки, а также обеспечивать робастность против потенциальных изменений производственного процесса в течение жизненного цикла лекарственного препарата.

ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ

Разработка процесс-специфичного метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина включает выбор нулевой клеточной линии, не содержащей ген экспрессии целевого продукта и полученной из клеточной линии, использованной при создании производственной клеточной линии, продуцирующей целевой белок. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно трансфицированной. Ложно трансфицированную линию клеток получают с помощью трансфекции родительской линии клеток плазмидой, используемой при создании производственной клеточной линии, но без гена, кодирующего целевой белок.

ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА

Процессы наработки продукта, содержащего целевой белок

Антигены для процесс-специфичного метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина получают, имитируя планируемый производственный процесс с использованием нулевой клеточной линии и, где это возможно, в одних и тех же условиях производства.

Любая имитация производственного процесса является приближением к предполагаемому производственному процессу, поэтому они могут иметь отличия, например, различный масштаб, рабочие параметры, взаимодействие продуктов. Такие отличия необходимо тщательно оценить, так как они могут повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина.

Например, при имитации стадии ферментации процесса производства телец включения, получение желаемых телец включения может быть не достигнуто. В связи с этим, в зависимости от используемой нулевой клеточной линии (например, ложно трансфицированной или не трансфицированной), антигены получают иначе, чем в предполагаемом производственном процессе.

В отдельных случаях для некоторых параметров производственного процесса при имитации производства может потребоваться корректировка с учётом наихудшего случая (например, для получения антигенов, охватывающих широкий спектр различных видов белков клетки-хозяина). Например, супернатант клеточной культуры, содержащий антиген, может быть собран уже после достижения минимального уровня жизнеспособности клеток, чтобы включить больше цитозольных белков, которые высвобождаются при дополнительном лизисе клеток.

Процессы выделения и очистки целевого белка

Полученные антигены подвергают щадящему воздействию (фильтрации, концентрированию) с целью получения репрезентативного спектра белков клетки-хозяина. Дальнейшую очистку не рекомендуется проводить, так как существует риск потери видового разнообразия остаточных белков. В случаях, когда не достигнута репрезентативность антигенов (например, в результате узкого охвата), можно рассмотреть возможность смешивания имитационных материалов с различных этапов обработки. Возможно увеличение разнообразия антигенов путём объединения материалов, полученных в результате процесса культивирования и очистки с использованием различных производственных условий, или селективных этапов очистки (например, для уменьшения общего количества некоторых иммунодоминантных остаточных белков клетки-хозяина).

Перекрёстная контаминация целевым белком

Существенным фактором риска при получении антигенов, используемых в качестве реактивов, является контаминация целевым белком с последующей перекрёстной реакцией с поликлональными антителами, что необходимо учитывать при организации производственного и лабораторного процессов. По этой причине при получении антигенов максимально используют специальное или одноразовое оборудование. Когда это невозможно, оборудование должно быть очищено соответствующим образом.

Определение характеристик и испытания

Перед использованием антигенов для иммунизации в них определяют общее содержание белка и подтверждают отсутствие целевого белка.

Сравнение совокупности белков клетки-хозяина, полученных в результате имитированного и предполагаемого производственных процессов, выполняют, как правило, при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и (или) двумерного электрофореза с высокочувствительным красителем. Сравнение должно показать, что антигены, полученные при имитации процесса, содержат большинство видов белков клетки-хозяина предполагаемого производственного процесса. При необходимости дополнительная информация может быть получена с помощью ортогональных методов (например, масс-спектрометрии).

ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

НУЛЕВАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ

Разработка платформенных методов количественного определения остаточных белков клетки-хозяина включает выбор нулевой клеточной линии, не содержащей ген экспрессии целевого продукта, и использование одного и того же вида клетки-хозяина. Нулевая клеточная линия может быть не трансфицированной или ложно трансфицированной и может быть использована для производства антигенов для целевых продуктов данной производственной площадки производителя.

ИМИТАЦИЯ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОЦЕССА

Наработка биоматериала, содержащего целевой белок

Антигены для испытаний с использованием платформенных методов получают с помощью имитации производственного процесса, используемого для нескольких целевых продуктов, обычно с использованием одних и тех же компонентов среды. При любой имитации производства используемый процесс должен быть максимально приближен к предполагаемому производственному процессу, так как это может повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина (см. раздел «Процесс-специфичные методы количественного определения остаточных белков»).

Процесс выделения и очистки целевого белка

Как и для других методов количественного определения, антигены белков клетки-хозяина, полученные на технологической стадии наработки биоматериала, как правило, обрабатывают лишь в минимальной степени (например, без стадий очистки или с ограниченным количеством стадий) для получения широкого спектра белков клетки-хозяина, в то же время стратегии смешивания и объединения также могут использоваться для расширения спектра видов белков клетки-хозяина.

Определение характеристик и испытания

Определяют общее содержание белка и подтверждают отсутствие целевого белка. Сравнивают белки клетки-хозяина, полученные при имитации процесса и в предполагаемом производственном процессе.

ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Общие методы количественного определения разрабатывает производитель готового набора реактивов. Подробная информация по производству реактивов может быть не раскрыта. Например, клеточная культура может быть получена из смеси штаммов экспрессирующих клеток одного типа (вида), а используемый процесс (процессы) может не совпадать с процессом, применяемым для конкретного лекарственного средства. Общие методы количественного определения должны быть выбраны с учётом предполагаемого конкретного производственного процесса (например, подходящая линия клетки-хозяина) и надлежащим образом валидированы для целевого продукта и этапа разработки.

Если общие методы количественного определения применяют на более поздних этапах разработки или во время промышленного производства, целесообразно валидировать методику количественного определения и контролировать постоянство состава реактивов от серии к серии, используя либо соответствующие предшествующие фракции из производственного процесса, либо образец целевого продукта, полученный при имитации процесса с использованием нулевой клеточной линии.

ПОЛУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИК АНТИТЕЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В КАЧЕСТВЕ РЕАКТИВОВ

ПРОЦЕСС-СПЕЦИФИЧНЫЕ И ПЛАТФОРМЕННЫЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕНННОГО ОПРЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Иммунизация

Для получения поликлональных антител иммунизируют один или несколько подходящих видов животных. Основной задачей иммунизации является получение высокоспецифичных поликлональных антител, чувствительных к каждому из антигенных белков в смеси белков клетки-хозяина, используемой в качестве иммуногена. Иммунный ответ животного должен индуцироваться как высокоиммунными, так и низкоиммунными антигенами.

Выбирают вид животного, использование которого позволяет получить достаточное количество и разнообразие специфического к белкам клетки-хозяина иммуноглобулина G.

Если поликлональные антитела для образования иммунного комплекса антиген-антитело (первичные антитела) и для детекции результатов реакции (вторичные антитела) получены из одного и того же источника, можно предположить, что при проведении количественного определения они распознают разные эпитопы на одном и том же белке клетки-хозяина. Альтернативно можно использовать поликлональные антитела к белкам клетки-хозяина от разных видов животных. Использование нескольких животных для каждого из данных видов позволяет уменьшить влияние индивидуальной изменчивости иммунной системы и обеспечить дополнительное разнообразие ответов, что будет способствовать максимальному охвату антителами против антигенов белков клетки-хозяина.

В случае ограниченного количества антигенов, использование адъювантов сокращает время формирования иммунного ответа. В случае сложного состава смеси антигенов может потребоваться дифференциальное усиление иммунного ответа к низкоиммуногенным антигенам или к антигенам в более низких концентрациях.

Для достижения максимального иммунного ответа может потребоваться несколько циклов иммунизации, и, в зависимости от частоты иммунизации, процесс может занять от 3 месяцев до 6 месяцев.

Иммунный ответ на белки клетки-хозяина для конкретной схемы иммунизации контролируют путём определения титра антител с использованием, например, ИФА, и путём сравнения результатов одно- или двумерного электрофореза после окрашивания белков и вестерн-блоттинга, где в качестве первичных антител используют поликлональные антитела к белкам клетки-хозяина. Некоторые белки, вызывающие сильный иммунный ответ, могут быть не видны в геле при окрашивании, в тоже время белки со слабыми антигенными свойствами, обнаруживаемые при окрашивании белков, могут не вызывать детектируемый иммунный ответ. В мультиплексных иммунологических испытаниях для достижения линейности при разведении образца важно, чтобы реактив, содержащий антитела, одновременно и специфически распознавал как можно больше отдельных молекул в образце, и присутствовал в стехиометрическом избытке. Для этой цели серии разведений испытуемых образцов, полученных на разных стадиях производственного процесса, предварительно оценивают с помощью твёрдофазного ИФА, используя для этого очищенные антитела белков клетки-хозяина, показавшие высокую эффективность в вестерн-блоттинге.

На основании результатов описанных выше испытаний антисыворотки от разных животных объединяют, повторно испытывают и очищают.

Очистка и подготовка

Антитела к белкам клетки-хозяина должны быть очищены. Как правило, применяют аффинную хроматографию на основе связывания с белком А или белком G и (или) аффинную хроматографию на основе антигена белка клетки-хозяина.

Может потребоваться дополнительная очистка для удаления потенциальных агрегатов с помощью эксклюзионной хроматографии.

Для ИФА часть очищенных антител к белкам клетки-хозяина конъюгируют с меткой, необходимой для детекции результатов реакции (например, биотином или пероксидазой хрена).

Очищенные антитела к белкам клетки-хозяина и антисыворотки хранят при температуре, обеспечивающей их стабильность.

Определение характеристик и испытания

Полученные и используемые в качестве реактивов поликлональные антитела должны обеспечивать связывание максимального спектра белков антигена и не давать перекрёстной реакции с целевым белком. Их пригодность оценивают путём подтверждения охвата белков клетки-хозяина, характерных для производственного процесса.

Для этого проводят двумерный электрофорез антигенов белков клетки-хозяина. Полученный белковый профиль после иммуноокрашивания сравнивают с белковым профилем, полученным при окрашивании неселективным красителем. Антитела к белкам клетки-хозяина должны распознавать широкий спектр белков клетки-хозяина при любых зарядах и молекулярных размерах. Могут быть рассмотрены другие подходящие методы.

ОБЩИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Иммунизацию, очистку и производство антител к белкам клетки-хозяина выполняет производитель готового набора реактивов, и подробная информация по производству может быть не представлена. В большинстве случаев возможен лишь ограниченный контроль за постоянством качества реактивов от серии к серии, в связи с чем необходимо проводить соответствующие сравнительные испытания серий.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ БЕЛКОВ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА

Метод твёрдофазного ИФА для определения остаточных белков клетки-хозяина разработан с целью обнаружения и количественного определения гетерогенной смеси антигенов, содержащихся в различных концентрациях, с помощью антител, добавляемых в соотношении не один к одному. Ниже описаны требования к разработке и валидации данного типа ИФА.

Методику испытания на остаточные белки клетки-хозяина методом ИФА валидируют по характеристикам: правильность, специфичность, прецизионность, предел количественного определения, предел обнаружения, линейность, диапазон применения и робастность. В течение жизненного цикла лекарственного препарата может потребоваться полная или частичная повторная валидация методики, например, при внесении изменений в производственный процесс, которые могут повлиять на пригодность антигенов.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Правильность подтверждают методом добавок и открываемости стандартного образца белка клетки-хозяина в соответствующей «фоновой» матрице (например, фармацевтическая субстанция или образец с соответствующего этапа очистки).

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность подтверждают отсутствием интерференции со стороны матрицы (например, содержащей фармацевтическую субстанцию). Для оценки специфичности могут быть использованы результаты проверки правильности.

ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Повторяемость, промежуточная прецизионность и воспроизводимость должны быть соответствующим образом подтверждены.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ

Чувствительность обычно находится в диапазоне частей на миллион (ppm) и выражается через предел количественного определения. Предел количественного определения, как правило, определяют методом добавок белков клетки-хозяина в фармацевтическую субстанцию или в соответствующую пробу матрицы и рассчитывают на основе минимальной добавки, обеспечивающей отклик с заданной правильностью и прецизионностью.

Предел обнаружения чаще всего не определяют, так как он не является обязательным параметром валидации.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Линейность методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина подтверждают с помощью серии разведений стандартного образца белка клетки-хозяина и изучения правильности.

В силу особенностей количественного определения остаточных белков клетки-хозяина, большим количеством видов белков и поликлональных антител белков клетки-хозяина, может наблюдаться нелинейность при разведениях образцов. Например, полученные путём обратных вычислений результаты возрастают по мере роста числа разведений образцов. В большинстве случаев это связано с излишком одного или нескольких отдельных белков клетки-хозяина в образце по сравнению с доступным количеством антител в ИФА белков клетки-хозяина. Как следствие, необходимо оценить линейность при разведениях для соответствующих стадий процесса путём сравнения целевой и измеренной концентрации остаточных белков клетки-хозяина при разной степени разведения пробы. Линейность методики считается подтверждённой, если для разных разведений образца соблюдаются критерии приемлемости. Исследования, подтверждающие линейность при разведениях образца, можно проводить при разработке метода или на этапе валидации.

Если при разведении образца отмечают отсутствие линейности, делают многократные разведения вне границ диапазона, в котором обнаруживается нелинейность.

Окончательное содержание остаточных белков клетки-хозяина обычно выражают как среднюю концентрацию белков клетки-хозяина, полученную как минимум для двух разведений в пределах линейного диапазона. При соответствующем обосновании может быть достаточно одного разведения.

ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ

Диапазон применения методики обычно определяют по концентрациям остаточных белков клетки-хозяина, для которых был показан подходящий уровень прецизионности, правильности и линейности.

РОБАСТНОСТЬ

Оценка робастности проводится на этапе разработки методики.

ЗАМЕНА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ И (ИЛИ) ИСПОЛЬЗУЕМЫХ РЕАКТИВОВ

Количество антигенов и антител должно быть достаточным, чтобы обеспечить возможность проведения испытания на остаточные белки клетки-хозяина в течение нескольких лет. Следовательно, обеспеченность и постоянство качества реактивов должны надлежащим образом управляться на протяжении всего жизненного цикла испытания.

Для общего метода количественного определения остаточных белков клетки-хозяина, чтобы убедиться в постоянстве качества реактивов, может потребоваться повторная проверка пригодности или повторная валидация методики для каждой новой серии реактива, поскольку их качество может меняться от одной серии к другой.

Для процесс-специфичных и для платформенных методов количественных определений необходимость в новых сериях реактивов для испытания на белки клетки-хозяина может возникнуть в двух основных случаях:

- исчерпаны запасы стандартного образца белков клетки-хозяина и (или) антител; в таком случае антитела могут быть выделены из запаса замороженной сыворотки или требуется новая иммунизация;

- изменение производственного процесса может повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина, присутствующих в очищенных промежуточных продуктах (полупродукты) или фармацевтической субстанции; реактив для испытания может не подходить для обнаружения и количественного определения модифицированных белков клетки-хозяина; поэтому изменение производственного процесса может обусловить непригодность реактивов для использования в испытании.

Вновь приготовленные реактивы должны быть тщательно охарактеризованы (например, сочетанием методов двумерного электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом и вестерн-блоттинга или сочетанием методов двумерного электрофореза в полиакриламидном геле с натрия додецилсульфатом с дифференциальным гель-электрофорезом и идентификацией с помощью масс-спектрометрии). Необходимо оценить валидационные характеристики методики с использованием новых реактивов. Проверку новых реактивов рекомендуется проводить параллельно с реактивами, применяемыми в валидированной ранее методике.

Таблица - 1. – Рекомендации по оценке пригодности реактивов и оценке валидационных характеристик методики испытания в случае истощения запаса используемых реактивов или внесения изменения в производственный процесс

	Реактив		Изменения в производственном процессе
	Антигены или стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина	Антитела к белкам клетки-хозяина
Оценка пригодности	Концентрацию белка в новой серии реактива предпочтительно определять с использованием тех же методов, что и для текущей (одобренной) серии реактива, чтобы обеспечить сопоставимость концентраций белка. С помощью подходящих методов (например, одно- или двумерный электрофорез, двумерный дифференциальный гель-электрофорез) оценивают сходство совокупностей видов белков между новой серией и текущей (одобренной) серией реактивов.	Определяют общую концентрацию белка новой серии антител. Конечную концентрацию для количественного определения необходимо установить для новой серии, чтобы получить такую же калибровочную кривую, что и для текущей (одобренной) серии реактива. Для детектирующих антител с меткой (вторичные антитела) контролируют стехиометрию белков для подтверждения аналогичности текущей (одобренной) серии антител. Иммунореактивность новой серии антител сравнивают качественно (визуальное сравнение) или полуколичественно (определение области охвата) с текущей (одобренной) серией подходящими методами (например, одно- или двумерный вестерн-блоттинг). Из-за изменчивости методики настоятельно рекомендуется проводить эту проверку пригодности параллельно с текущей (одобренной) серией антител.	Эффекты изменений производственного процесса, которые могут повлиять на совокупность видов белков клетки-хозяина, проверяют подходящими методами (например, одно- или двумерный электрофорез, вестерн-блоттинг, количественное определение белков клетки-хозяина). Если изменение производственного процесса не приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, но была подтверждена пригодность текущих (одобренных) реактивов, то текущие (одобренные) реактивы подходят для нового производственного процесса. Если изменение производственного процесса приводит к соответствующему изменению совокупности видов белков клетки-хозяина, и было показано, что текущие (одобренные) реактивы не подходят для нового производственного процесса, необходимо разработать новую методику испытания, включая пробную ферментацию в соответствии с новым производственным процессом и новую иммунизацию.
Испытание реактивов для количественного определения остаточных белков клетки-хозяина	Новую серию реактива испытывают в сравнении с текущей (одобренной) серией реактива с использованием метода добавок при различных концентрациях в пределах диапазона применения методики. Сравнивают сходимость калибровочных кривых, полученных с использованием новой серии реактива и текущей (одобренной) серии реактива.	Сравнивают калибровочные кривые, полученные при использовании новых и текущих (одобренных) серий антител. Сокращённое исследование проводят с испытанием соответствующих технологических образцов (например, начиная от стадии очистки полупродукта до получения фармацевтической субстанции). В параллельном эксперименте новая серия антител должна обнаруживать белки клетки-хозяина на разных этапах процесса в той же концентрации или ниже, что обнаруживает текущая (одобренная) серия антител.	Сбор, полученный в пробном этапе нового процесса, проверяют на открываемость добавки с использованием текущей методики количественного определения остаточных белков клетки-хозяина. Образцы, соответствующие стадии производственного процесса (например, начиная от стадии очистки сбора до получения фармацевтической субстанции) из нового и текущего процессов проверяют параллельно.
Оценка валидационного статуса	Если проверка пригодности реактивов и испытания ИФА показали соответствие нового стандартного образца белка (белков) клетки-хозяина, текущий (одобренный) стандартный образец может быть заменён. Повторная валидация методики испытания не требуется. Если новый стандартный образец белка (белков) клетки-хозяина значительно отличается по совокупности видов белков и (или) по рабочим характеристикам в количественном определении от текущего (одобренного) стандартного образца, требуется повторная валидация методики.	Если проверка пригодности реактивов и испытания ИФА показывают соответствие новой серии антител, текущая (одобренная) серия антител может быть заменена. Повторная валидация методики испытания не требуется. Если новая серия антител значительно отличается по иммунореактивности вестерн-блоттинга или чувствительности иммуноанализа и (или) по рабочим характеристикам в количественном определении от текущей (одобренной) серии антител, требуется повторная валидация методики.	Если для нового производственного процесса текущая (одобренная) серия антител показывает аналогичную или более высокую иммунореактивность по сравнению с предыдущим процессом, и результат количественного определения остаточных белков клетки-хозяина подтверждает приемлемую открываемость белков клетки-хозяина из пробного сбора нового процесса, а также аналогичную или более высокую чувствительность для образцов из соответствующих стадий производственного процесса, то текущая методика количественного определения и реактивы считаются подходящими для нового процесса. Повторная валидация методики испытаний не требуется. Если ИФА обнаруживает существенные различия в открываемости добавки белков клетки-хозяина или в определяемых концентрациях белков клетки-хозяина на отдельных стадиях для текущего и нового процессов, при том, что реактивы признаны подходящими, требуется повторная валидация методики. Изменение производственного процесса может также повлиять на линейность разведения испытуемых образцов из отдельных стадий производственного процесса; если эти стадии являются критическими с точки зрения стратегии контроля содержания остаточных белков клетки-хозяина, может потребоваться повторная валидация или даже создание новых реактивов антител. В случае существенного изменения совокупности видов белков клетки-хозяина в новом производственном процессе, которое приводит либо к несоответствию совокупности видов белков по сравнению с текущим (одобренным) стандартным образцом (антигенами), либо к снижению иммунореактивности антител, либо к значительному снижению чувствительности иммунологического анализа, готовят новые реактивы для анализа и проводят валидацию методики анализа с использованием новых реактивов.