Микробиологические испытания лекарственных препаратов, содержащих живые микроорганизмы: общее количество микроорганизмов

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

В общей фармакопейной статье приведены методы испытания, позволяющие проводить количественный подсчёт контаминантов лекарственных препаратов, содержащих живые микроорганизмы в качестве действующего вещества (ОФС «Лекарственные препараты, содержащие живые микроорганизмы») (далее продукт): мезофильных бактерий, дрожжевых и плесневых грибов, способных расти в аэробных условиях.

Испытания предназначены, прежде всего, для установления соответствия лекарственных препаратов, содержащих живые микроорганизмы (ОФС «Лекарственные препараты, содержащие живые микроорганизмы») (далее продукт) критериям приемлемости микробиологического качества.

Допустимо использование альтернативных микробиологических методик (ОФС «Альтернативные методы контроля микробиологического качества лекарственных средств»), включая автоматизированные, при условии подтверждения их эквивалентности фармакопейному методу.

2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Испытания проводят в условиях, разработанных для предотвращения внешней микробной контаминации испытуемого образца. Меры предосторожности, предпринимаемые для предотвращения контаминации, не должны влиять ни на один из микроорганизмов, которые должны быть обнаружены в ходе испытания.

Если испытуемый продукт не позволяет обнаружить указанные контаминирующие микроорганизмы применяют схему принятия решений, представленную на рисунке 1.

Рисунок 1 – Схема принятия решений для испытаний на наличие контаминации аэробными микроорганизмами

Если компоненты испытуемого продукта, помимо действующего вещества (т.е. микроорганизма), обладают антимикробным действием, то данные компоненты, насколько это возможно, должны быть удалены или нейтрализованы, как описано в ОФС «Микробиологические испытания нестерильных продуктов: общее количество микроорганизмов». Если для этой цели используют инактиваторы, должна быть подтверждена их эффективность и отсутствие токсичности в отношении указанных контаминирующих микроорганизмов.

Если для пробоподготовки испытуемого образца используют поверхностно-активные вещества (ПАВ), должна быть подтверждена их совместимость с инактиваторами и отсутствие токсичности в отношении микроорганизмов-контаминантов.

3. МЕТОДЫ ПОДСЧЁТА

Используют чашечные методы или метод наиболее вероятных чисел (НВЧ). Метод НВЧ является наименее точным методом подсчёта микроорганизмов.

Выбор метода основывают на таких факторах, как свойства продукта и нормируемый предел содержания контаминирующих микроорганизмов Выбранный метод должен обеспечивать проведение испытания на количестве образца, достаточном для оценки соответствия установленным критериям приемлемости микробиологического качества. Должна быть установлена пригодность выбранного метода.

4. ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ (СПОСОБНОСТЬ ОБЕСПЕЧИВАТЬ РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ) СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИГОДНОСТИ МЕТОДА ПОДСЧЁТА И ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ КОНТРОЛИ

4.1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Должна быть подтверждена возможность обнаружения микроорганизмов в присутствии испытуемого продукта. При внесении в методику или в продукт каких-либо изменений, которые могут повлиять на результат испытания, должна быть подтверждена пригодность методики.

4.2. ПОДГОТОВКА ТЕСТ-ШТАММОВ

Используют стандартизованные стабильные суспензии тест-штаммов микроорганизмов или их готовят, как указано ниже. Посевные культуры при проведении испытания используют таким образом, чтобы жизнеспособные микроорганизмы для инокуляции были из пассажа, не превышающего пятого пассажа от главной посевной культуры.

Каждый тест-штамм бактерий или грибов выращивают отдельно, в соответствии с указаниями в таблице 1.

Таблица 1 – Подготовка и использование тест-штаммов микроорганизмов

Для приготовления суспензий тест-штаммов используют натрия хлорида и пептона забуференный раствор с рН 7,0 или фосфатный буферный раствор с рН 7,2; для суспендирования спор A. brasiliensis к буферному раствору можно добавить 0,05 % раствор полисорбат 80. Суспензии используют в течение двух часов или в течение 24 ч при условии хранения при температуре от 2 °C до 8 °С. В качестве альтернативы приготовлению и последующему разведению свежеприготовленной суспензии вегетативных клеток A. brasiliensis или В. subtilis готовят стабильную суспензию спор, затем для инокуляции используют подходящий объём суспензии спор. Стабильную суспензию спор можно хранить при температуре от 2 °С до 8 °С в течение валидированного периода времени.

4.3. ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ

Для проверки условий испытания проводят отрицательный контроль с использованием выбранного растворителя (разбавителя) вместо испытуемого образца. Рост микроорганизмов наблюдаться не должен. Отрицательный контроль проводят также при испытании продукта (см. раздел 5. Испытание продукта). При неудовлетворительном отрицательном контроле проводят расследование.

4.4. ПРОВЕРКА РОСТОВЫХ СВОЙСТВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Испытанию подлежит каждая серия готовой питательной среды, а также каждая серия питательной среды, приготовленная из сухой среды или из отдельных компонентов.

Инокулируют ёмкости с порциями соево-казеинового бульона и соево-казеиновым агаром небольшим количеством (не более 100 КОЕ) микроорганизмов (Таблица 1), используя для каждого микроорганизма отдельную ёмкость и (или) чашку со средой. В чашки с агаром Сабуро с декстрозой инокулируют небольшое количество (не более 100 КОЕ) микроорганизмов (Таблица 1), используя для каждого из микроорганизмов отдельные чашки. Инкубируют в условиях, описанных в таблице 1.

Для плотной среды количество выросших микроорганизмов не должно отличаться более чем в два раза от расчётного значения для инокулята стандартизованной суспензии. Для свежеприготовленного посевного материала должен наблюдаться рост микроорганизмов, сопоставимый с ростом, полученным на ранее проверенной и пригодной серии среды. Жидкая среда пригодна к использованию, если наблюдается чётко видимый рост микроорганизмов, сопоставимый с ростом, полученным на ранее проверенной и пригодной серии среды.

4.5. ПРИГОДНОСТЬ МЕТОДА ПОДСЧЁТА В ПРИСУТСТВИИ ПРОДУКТА

4.5.1. Подготовка образца

Метод подготовки образца зависит от физических характеристик испытуемого продукта. Если невозможно подтвердить пригодность ни одного из методов, описанных ниже, может быть разработан альтернативный метод.

Готовят однородную суспензию испытуемого продукта (обычно готовят разведение 1 к 10) в натрия хлорида и пептона забуференном растворе с рН 7,0, фосфатном буферном растворе с рН 7,2 или соево-казеиновом бульоне. Для улучшения суспендирования плохо смачиваемых веществ может быть добавлено поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80 c концентрацией 1 г/л. Если необходимо, доводят рН до значения от 6 до 8. Если необходимо, готовят дальнейшие разведения с тем же разбавителем (растворителем).

4.5.2. Инокуляция и разведение

К образцу, приготовленному, как описано в подразделе 4.5.1. Подготовка образца, и к контрольному образцу (не содержащему испытуемый образец) прибавляют достаточный объём суспензии микроорганизмов для получения инокулята, содержащего не более 100 КОЕ. Объём инокулята не должен превышать 1 % от объёма разведённого продукта.

Для приемлемого извлечения микроорганизмов из продукта в испытании используют наименьшее разведение для подготовки образца. В случае, когда это невозможно из-за антимикробного действия, должны быть разработаны соответствующие протоколы испытания (см. схему принятия решений, представленную на рисунке 1). Если ингибирование роста микроорганизмов испытуемым образцом невозможно избежать другим способом, аликвота суспензии тест-штаммов микроорганизмов может быть добавлена после нейтрализации антимикробного действия или разведения.

Антимикробное действие продукта. Количество микроорганизмов, извлечённых в подготовленном образце, разведённом (см. подраздел 4.5.2. Инокуляция и разведение) и инкубированном (см. подраздел 4.5.3. Выявление микроорганизмов в присутствии продукта), сравнивают с количеством микроорганизмов, извлечённых в контрольном образце.

При ингибировании роста микроорганизмов (снижение более, чем в два раза), следуют схеме принятия решений, представленной на рисунке 1, и в данную методику вносят соответствующие изменения, чтобы обеспечить достоверность получаемых результатов. Изменения методики могут включать, например, (1) увеличение объёма растворителя (разбавителя) или питательной среды, (2) введение в состав растворителя (разбавителя) специфических или неспецифических нейтрализующих веществ, (3) мембранную фильтрацию, (4) сочетание вышеописанных мер.

Если рост по-прежнему остается подавленным (снижение более чем в два раза), то продолжают следовать схеме принятия решений, представленной на рисунке 1.

Альтернативная методика должна быть валидирована с использованием соответствующих параметров в зависимости от степени изменения, при этом должно быть подтверждено, что изменения не снижают КАМ или КГ.

4.5.3. Выявление микроорганизмов в присутствии продукта

Для каждого из перечисленных тест-штаммов микроорганизмов проводят отдельное испытание. Подсчитывают только микроорганизмы добавленного тест-штамма.

4.5.3.1. Чашечные методы

Чашечный подсчёт выполняют не менее чем в двух повторностях для каждой питательной среды и используют среднее значение результата.

4.5.3.1.1. Метод глубинного посева

При использовании чашек Петри диаметром 9 см в каждую чашку помещают 1 мл подготовленного образца (см. подразделы 4.5.1. Подготовка образца, 4.5.2. Инокуляция и разведение), и от 15 до 20 мл соево-казеинового агара или агара Сабуро с декстрозой, температура обеих сред не должна превышать 45 °С. Если используют чашки Петри большего размера, то пропорционально увеличивают количество агаровой среды. Для каждого из микроорганизмов (Таблица 1), используют не менее двух чашек Петри. Чашки инкубируют в соответствии с условиями, указанными в таблице 1. Вычисляют среднее арифметическое значение количества колоний на каждой питательной среде и рассчитывают количество КОЕ в исходном посевном материале.

4.5.3.1.2. Метод поверхностного посева

Используют чашки Петри диаметром 9 см. В каждую чашку помещают от 15 до 20 мл соево-казеинового агара или агара Сабуро с декстрозой при температуре около 45 °С, и дают среде застыть. Если используют чашки Петри большего диаметра, то пропорционально увеличивают количество агаровой среды. Чашки сушат, например, в ламинарном шкафу или в инкубаторе. Для каждого из микроорганизмов (Таблица 1), используют не менее двух чашек Петри. Распределяют не менее 0,1 мл подготовленного образца (см. подразделы 4.5.1. Подготовка образца, 4.5.2. Инокуляция и разведение), по поверхности среды. Инкубируют и проводят подсчёт количества КОЕ (см. подраздел 4.5.3.1.1. Метод глубинного посева).

4.5.3.2. Метод наиболее вероятных чисел

Метод наиболее вероятных чисел (НВЧ) уступает по прецизионности и точности методу чашечного подсчёта. Метод даёт недостоверные результаты, в частности, при подсчёте плесневых грибов. Метод НВЧ применяют для подсчёта КАМ только в тех случаях, когда другие методы неприменимы. Если использование метода обосновано, испытание проводят следующим образом.

Готовят серию из не менее трёх последовательных десятикратных разведений подготовленного образца (см. подразделы 4.5.1. Подготовка образца, 4.5.2. Инокуляция и разведение). Для каждого разведения используют по три аликвоты по 1 г или 1 мл для посева в три пробирки, содержащие от 9 мл до 10 мл соево-казеинового бульона. При необходимости, к питательной среде могут быть добавлены ПАВ, например, полисорбат 80. Таким образом, при использовании трёх степеней разведения, посев проводят в девять пробирок. Все пробирки инкубируют при температуре от 30 °С до 35 °С в течение не более трёх дней. Если подсчёт результатов затруднён или неоднозначен из-за свойств испытуемого продукта, производят пересев на ту же жидкую среду или на соево-казеиновый агар, инкубируют при той же температуре в течение от одного до двух дней, и полученные результаты используют для подсчёта. Наиболее вероятное количество микроорганизмов в грамме или миллилитре продукта определяют в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2 – Наиболее вероятное количество микроорганизмов

4.6. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

При проверке пригодности чашечных методов среднее количество колоний любого тест-штамма микроорганизма, полученное в испытании, не должно отличаться более чем в два раза от количества микроорганизмов, полученных при испытании контроля (см. подраздел 4.5.2. Инокуляция и разведение) в отсутствие испытуемого продукта. При проверке пригодности метода НВЧ рассчитанное значение в инокуляте, ожидаемое при посеве испытуемого образца, должно находиться в пределах 95 % доверительного интервала результатов, полученных при контроле.

Если вышеперечисленные критерии не могут быть выполнены при испытании, следуют схеме принятия решений (Рисунок 1), и в данную методику вносят соответствующие изменения, чтобы обеспечить достоверность получаемых результатов.

5. ИСПЫТАНИЕ ПРОДУКТА

5.1. КОЛИЧЕСТВО ПРОДУКТА, ИСПОЛЬЗУЕМОЕ В ИСПЫТАНИЯХ

При отсутствии других указаний, для испытаний используют 10 г или 10 мл испытуемого продукта, с соблюдением мер предосторожности, указанных выше.

Если общее количество единиц в серии испытуемого продукта составляет менее 200 (например, образцы, используемые в клинических испытаниях), размер выборки может быть уменьшен до двух единиц или до одной единицы, если размер серии составляет менее 100.

Образец(-цы) отбирают случайным образом из готового нерасфасованного продукта или из имеющихся упаковок лекарственного препарата. Для получения необходимого количества образца перемешивают содержимое достаточного количества первичных упаковок.

5.2. ИСПЫТАНИЕ ПРОДУКТА

5.2.1. Чашечные методы

5.2.1.1. Метод глубинного посева

Образец подготавливают с использованием методики, пригодность которой была подтверждена (см. раздел 4. Проверка ростовых (способность обеспечивать рост микроорганизмов) свойств питательных сред, подтверждение пригодности метода подсчёта и отрицательные контроли). Для каждой среды используют не менее двух чашек Петри для каждого из разведений. Чашки с соево-казеиновым агаром инкубируют при температуре от 30 °С до 35 °С в течение от трёх до пяти суток, чашки с агаром Сабуро с декстрозой инкубируют при температуре от 20 °С до 25 °С в течение от пяти до семи суток. Выбирают чашки, соответствующие определённому разведению и содержащие наибольшее число колоний, но менее 250 аэробных контаминирующих микроорганизмов и менее 50 контаминирующих дрожжевых и плесневых грибов. Определяют среднее арифметическое значение подсчитанных колоний на питательной среде и вычисляют число КОЕ на грамм или миллилитр продукта.

5.2.1.2. Метод поверхностного посева

Образец подготавливают с использованием методики, пригодность которой была подтверждена (см. раздел 4. Проверка ростовых (способность обеспечивать рост микроорганизмов) свойств питательных сред, подтверждение пригодности метода подсчёта и отрицательные контроли). Для каждой среды используют не менее двух чашек Петри для каждого из разведений. Инкубируют и вычисляют количество КОЕ, согласно указаниям, приведённым для метода глубинного посева.

5.2.2. Метод наиболее вероятных чисел

Образец подготавливают с использованием методики, пригодность которой была подтверждена (см. раздел 4. Проверка ростовых (способность обеспечивать рост микроорганизмов) свойств питательных сред, подтверждение пригодности метода подсчёта и отрицательные контроли). Все пробирки инкубируют при температуре от 30 °С до 35 °С в течение от трёх суток до пяти суток. При необходимости проводят пересев, используя процедуру, пригодность которой была подтверждена. Для каждого из разведений подсчитывают количество пробирок, в которых обнаружен рост микроорганизмов. Определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов на грамм или миллилитр продукта (Таблица 2).

5.3. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

КАМ считают равным количеству КОЕ, обнаруженных на соево-казеиновом агаре; если на этой среде обнаруживают колонии грибов, их подсчитывают, как часть КАМ. Общее количество контаминирующих дрожжевых и плесневых грибов считают равным количеству КОЕ на агаре Сабуро с декстрозой; если на этой среде обнаруживают колонии бактерий, их можно исключить из КГ. В случае превышения КГ критерия приемлемости из-за роста бактерий может быть использован агар Сабуро с декстрозой, содержащий антибиотики (см. схему принятия решений, представленную на рисунке 1). Если подсчёт выполнен методом НВЧ, то рассчитанное значение представляет собой КАМ.

Критерии приемлемости микробиологического качества интерпретируют следующим образом:

– 10¹ КОЕ: максимально допустимое число = 20;

– 10² КОЕ: максимально допустимое число = 200;

– 10³ КОЕ: максимально допустимое число = 2000 и т. д.

Рекомендуемые растворы и питательные среды приведены в ОФС «Микробиологические испытания нестерильных продуктов: отдельные виды микроорганизмов».

6. ПОДХОДЫ К ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОЛИЧЕСТВА КОНТАМИНИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ НАЛИЧИИ АНТИМИКРОБНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОДУКТА

Данный раздел следует рассматривать как информационный. Возможно проведение других испытаний, если их применение обосновано. Ниже приведены примеры подходов к определению количества микробных контаминантов для продуктов, обладающих антимикробным действием.

Каждый подход должен быть проверен с использованием соответствующих параметров в зависимости от степени изменения. При этом должно быть подтверждено, что вносимые изменения не уменьшают КАM или КГ.

Используют тест-штаммы микроорганизмов, указанные в таблице 1. Подготовку тест-штаммов осуществляют, как описано в разделе 4.2. Подготовка тест-штаммов. Отрицательный контроль проводят по методикам, описанным в разделе 4.3. Отрицательный контроль. Проверку ростовых свойств и пригодность новой выбранной питательной среды осуществляют путём инокуляции каждой партии среды небольшим количеством (не более 100 КОЕ) микроорганизмов. Полученные результаты роста микроорганизмов не должны отличаться более чем в два раза от расчётного значения для стандартизированного инокулята, подсчитанного на соево-казеиновом агаре для контаминирующих аэробных микроорганизмов или агаре Сабуро c декстрозой для контаминирующих дрожжевых и плесневых грибов.

6.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАМ

Продукты, содержащие молочнокислые бактерии, могут быть проверены на аэробную микробную контаминацию на агаровых средах без сахара, инкубируемых в аэробных условиях при температуре от 30 °С до 35° C в течение 72 ч. Молочнокислые бактерии растут медленно, в виде точечных колоний, в то время как контаминанты легко обнаружить в виде больших быстрорастущих колоний.

В качестве альтернативы, аэробную микробную контаминацию можно проверить на соево-казеиновом агаре с 5 % овечьей (бараньей) крови при температуре от 30 °С до 35° C в течение от 44 ч до 48 ч. Добавление крови способствует росту контаминантов и формированию характерной морфологии колоний, что облегчает их дифференциацию в присутствии молочнокислых бактерий.

Для продуктов, содержащих споры Bacillus clausii, аэробную микробную контаминацию можно определить на спорулирующем агаре. Среда, стимулирующая споруляцию Bacillus clausii, подавляет вегетативный рост микроорганизмов продукта, что позволяет обнаружить контаминанты. Чашки инкубируют при температуре от 33 °С до 37° C в течение 48 ч.

Для продуктов, содержащих Saccharomyces cerevisiae, var. boulardii, может быть проведено испытание на аэробную микробную контаминацию на соево-казеиновом агаре, содержащим циклогексимид – подходящий ингибитор для Saccharomyces. Чашки инкубируют при температуре от 30 °С до 35° C в течение от трёх до пяти суток.

Продукты, для которых отсутствуют подходящие среды и условия роста для определения аэробной микробной контаминации, проверяют не только на отсутствие специфических загрязнителей (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. и грамотрицательных бактерий, устойчивых к желчи) с помощью метода, описанного в ОФС «Микробиологические испытания лекарственных препаратов, содержащих живые микроорганизмы: отдельные виды микроорганизмов», но и проводят испытания на другие контаминирующие микроорганизмы на основе оценки риска (например, специфические контаминанты окружающей среды).

6.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КГ

Для продуктов, содержащих бактерии, испытания можно проводить на агаре Сабуро с декстрозой, с добавлением антимикробных препаратов (например, хлорамфеникол). Чашки инкубируют при температуре от 20 °С до 25° C в течение от пяти до семи суток.

Для продуктов, содержащих Saccharomyces cerevisae, var. boulardii, количество контаминирующих дрожжевых и плесневых грибов можно определить используя нескольких сред (агар Сабуро с декстрозой, дополненный хлорамфениколом и циклогексимидом, агар Чапека-Докса, картофельный агар с декстрозой).