ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Грамицидин состоит из смеси линейных полипептидов, выделенных путём экстракции из тиротрицина, полученного в процессе ферментации Brevibacillus brevis Dubos. Основные компоненты: грамицидины A1, A2, B1, C1 и C2.

Содержание: не менее 900 МЕ/мг в пересчёте на сухую субстанцию.

СВОЙСТВА

Описание. Белый или почти белый кристаллический порошок.

Слегка гигроскопичен.

Растворимость. Практически нерастворим в воде, растворим в метаноле и мало растворим в спирте 96 %.

Температура плавления. Около 230 °С.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Первая идентификация: А, В.

Вторая идентификация: А, Б.

А. Спектрофотометрия (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).

Испытуемый раствор. 0,100 г испытуемого образца растворяют в спирте 96 % и доводят объём раствора тем же растворителем до 100,0 мл. 5,0 мл полученного раствора разбавляют спиртом 96 % до 100,0 мл.

Спектральный диапазон: 240–320 нм.

Максимумы поглощения: 282 нм и 290 нм.

Плечо: 275 нм.

Минимум поглощения: 247 нм.

Удельный показатель поглощения в максимуме поглощения при 282 нм: от 105 до 125.

Б. Тонкослойная хроматография (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

Испытуемый раствор. 5 мг испытуемого образца растворяют в спирте 96 % и доводят объём раствора тем же растворителем до 6,0 мл.

Раствор сравнения (а) 5 мг фармакопейного стандартного образца грамицидина растворяют в спирте 96 % и доводят объём раствора тем же растворителем до 6,0 мл.

Раствор сравнения (б) 5 мг фармакопейного стандартного образца тиротрицина растворяют в спирте 96 % и доводят объём раствора тем же растворителем до 6,0 мл.

Условия хроматографирования:

- ТСХ пластинка со слоем силикагеля;

- подвижная фаза: метанол – бутанол – вода – уксусная кислота ледяная – бутилацетат (3:9:15:24:49 об/об/об/об/об);

- наносимый объём пробы: 1 мкл;

- высушивание: на воздухе;

- детектирование: помещают пластинку в раствор диметиламинобензальдегида 2 %, выдерживают при 90 °С до появления зоны адсорбции;

Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (б)):

- должны обнаруживаться 2 чётко разделённые зоны адсорбции или 2 чётко разделённые группы зон адсорбции.

Требование: на хроматограмме испытуемого раствора основная зона адсорбции или группа основных зон адсорбции должна соответствовать по положению, величине и окраске основной зоне адсорбции или группе основных зон адсорбции на хроматограмме раствора сравнения (а) и зоне адсорбции или группе зон адсорбции с самым высоким значением фактора замедления (фактор удерживания) R_f на хроматограмме раствора сравнения (б).

В. Жидкостная хроматография. Используют хроматограммы, полученные в испытании «Компонентный состав».

Требование: на хроматограмме испытуемого раствора времена удерживания 3 основных пиков должны соответствовать временам удерживания 3 основных пиков на хроматограмме раствора сравнения (а).

ИСПЫТАНИЯ

Компонентный состав. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Все растворы готовят непосредственно перед использованием.

Испытуемый раствор. 25 мг испытуемого образца растворяют в 10 мл метанола и доводят объем раствора подвижной фазой до 25 мл.

Раствор сравнения (а). 25 мг фармакопейного стандартного образца грамицидина растворяют в 10 мл метанола и доводят объём раствора подвижной фазой до 25 мл.

Раствор сравнения (б). 1,0 мл раствора сравнения (а) разбавляют до 50 мл подвижной фазой. 1,0 мл полученного раствора разбавляют подвижной фазой до 10,0 мл.

Условия хроматографирования:

- колонка: длиной 0,25 м и внутренним диаметром 4,6 мм; заполненная силикагелем октадецилсилильным, деактивированный по отношению к основаниям, эндкепированным, для хроматографии с размером частиц 5 мкм;

- температура колонки: 50 °С;

- подвижная фаза: вода – метанол (29:71 об/об);

- скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

- детектор: спектрофотометрический – длина волны, 282 нм;

- вводимый объём пробы: 20 мкл;

- время хроматографирования: должно в 2,5 раза превышать время удерживания грамицидина A1.

Идентификация компонентов: для идентификации пиков компонентов грамицидинов A1, A2, B1, C1 и C2 используют хроматограмму раствора сравнения (а) и хроматограмму, прилагаемую к фармакопейному стандартному образцу грамицидина и относительные времена удерживания соединений.

Относительное время удерживания (время удерживания грамицидина A1 – около 22 мин): грамицидин C1 – около 0,7; грамицидин C2 – около 0,8; грамицидин A2 – около 1,2; грамицидин B1 – около 1,9.

Пригодность хроматографической системы (раствор сравнения (а)):

- разрешение (R_S): не менее 1,5 между пиками грамицидина A1 и грамицидина A2.

Содержание каждого компонента грамицидин A1, грамицидин A2, грамицидин B1, грамицидин C1, грамицидин C2 в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»):

- сумма грамицидинов A1, A2, B1, C1 и C2 – не менее 95,0 %;

- отношение грамицидина A1 к сумме грамицидинов A1, A2, B1, C1 и C2: не менее 0,60;

- неучитываемый предел: площадь пика грамицидина А1 на хроматограмме раствора сравнения (б).

Родственные примеси. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») в условиях, описанных в испытании «Компонентный состав».

Содержание родственных примесей вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»).

Пределы содержания примесей:

- любые примеси – не более 2,0 %;

- не более одного пика более 1,0 %;

- не учитывают пики грамицидинов A1, A2, B1, C1 и C2.

Остаточные органические растворители (ОФС «Остаточные органические растворители»).

Потеря в массе при высушивании (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 2). Не более 3,0 %. 1,000 г испытуемого образца высушивают в глубоком вакууме при температуре 60 °С в течение 3 ч.

Сульфатная зола (ОФС «Сульфатная зола»). Не более 1,0 %.

Определение проводят с использованием 1,0 г испытуемого образца.

Микробиологическая чистота. Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на микробиологическую чистоту.

Испытание проводят для нестерильных субстанций.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Микробиологический метод (ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков»).

ХРАНЕНИЕ

В воздухонепроницаемой упаковке, в защищённом от света месте.