Биологические индикаторы, используемые при производстве стерильной продукции

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ОФС.0.0.0000

Взамен ОФС.1.1.0016.18

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СТЕРИЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ

1. ВВЕДЕНИЕ

В общей фармакопейной статье приведены подходы к использованию биологических индикаторов, предназначенных для контроля стерилизации готовых продуктов и соответствующих связанных процессов стерилизации, т. е. процессов стерилизации предметов, находящихся в непосредственном контакте с готовым стерилизованным продуктом. Общая фармакопейная статья не распространяется на использование биологических индикаторов для валидации процесса стерилизации иных объектов, не вступающих в непосредственный контакт со стерильным лекарственным средством.

Биологические индикаторы представляют собой тест-системы, содержащие жизнеспособные микроорганизмы (обычно споры бактерий) и предназначенные для проверки требуемой эффективности определённого процесса стерилизации.

Биологические индикаторы предназначены для разработки и валидации процессов стерилизации, но не предназначены для рутинного мониторинга, если иное не указано в данной общей фармакопейной статье.

Валидность процесса стерилизации и пригодность биологических индикаторов можно подтвердить с помощью сокращённого цикла стерилизации, при проведении которого небольшая часть микроорганизмов в биологическом индикаторе способна выжить. Однако при использовании валидированного процесса стерилизации выживших жизнеспособных микроорганизмов не должно быть обнаружено (см. подраздел 3.1.2. Установление цикла валидации).

Споры бактерий – устойчивые формы жизни, их можно производить и стандартизировать, а также хранить в течение длительного времени в подходящих условиях.

Готовые к использованию биологические индикаторы обычно содержат стандартизированную популяцию спор подходящей бактерии. В случаях, когда отсутствуют подходящие готовые биологические индикаторы для характеристики стерилизующего эффекта в продукте или в труднодоступных для стерилизующего агентах зонах, куда трудно проникнуть стерилизующему веществу, используют специализированные биологические индикаторы. Такие биологические индикаторы готовят путём инокуляции стандартизированной суспензии спор на изделие или в продукт, подлежащий стерилизации, что может изменить характеристики биологического индикатора.

При применении в качестве этапа стерилизации в асептическом производственном процессе стерилизующих фильтров их способность удерживать бактерии подтверждают, используя суспензию вегетативных клеток.

2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ПРОЦЕССОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Кроме физических параметров стерилизации, описанных в ОФС «Методы обеспечения стерильности лекарственных средств», эффективность процесса стерилизации зависит от большого числа факторов, например, от количества и устойчивости контаминирующих микроорганизмов, проникновения стерилизующего агента, времени, температуры, концентрации, pH, содержания влаги и химического состава стерилизуемого продукта или изделия.

Для валидации процесса стерилизации выбирают физические условия, при которых ожидают достижения уровня обеспечения стерильности не более  содержания жизнеспособных микроорганизмов (ОФС «Методы обеспечения стерильности лекарственных средств»). В процессе валидации подтверждают однородность физических условий для всех частей и положений загрузки. Целью биологической валидации является подтверждение корреляции между прогнозируемым влиянием физических условий, применяемых в ходе процесса, и наблюдаемым биологическим воздействием (эффектом) на биологические индикаторы. Использование параметров процесса, подтвердивших требуемый биологический эффект, обеспечит стерильность получаемого продукта при рутинном процессе.

Выбор типа биологического индикатора зависит от:

– природы стерилизующего агента (например, температура, газ или радиация);

– ожидаемой эффективности обработки (например, F_phys, рассчитанное на основе параметров процесса);

– условий процесса (например, температуры, времени, относительной влажности, концентрации газа, дозы радиации);

– характеристик стерилизуемого фармацевтического продукта (лекарственного средства) или изделия (например, конечной упаковки, упаковочного материала, посуды, такой, как пробирки или насосы).

При разработке процесса стерилизации оценивают продукт и его загрузку для определения наиболее труднодоступных для стерилизующего агента зон (например, так называемые «холодные точки», место стыковки упаковки и укупорочного средства (система упаковки – укупорка) и др.). При выборе оптимальной биологической нагрузки для процесса стерилизации следует максимально точно моделировать условия в наиболее проблемных зонах загрузки и продукте.

По сравнению с готовыми к использованию биологическими индикаторами споры, инокулированные в продукт или на поверхности, реагируют на условия стерилизации иначе. В этих случаях готовые к использованию биологические индикаторы могут не подходить для проверки эффективности стерилизации, поэтому лучшей моделью для оценки эффективности цикла стерилизации может быть специализированный тестовый продукт/изделие, инокулированный хорошо охарактеризованной суспензии спор.

2.1. ОПИСАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ ДЛЯ ПРОЦЕССОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ

В зависимости от процесса, который необходимо охарактеризовать, используют разные типы биологических индикаторов, представленные в виде суспензий тестовых микроорганизмов, инокулированных носителей или автономных биологических индикаторов.

Перед использованием должно быть установлено, что характеристики биологического индикатора отвечают заявленным требованиям (см. подраздел 2.2. Требования к качеству биологических индикаторов). В качестве альтернативы, заявленные характеристики биологических индикаторов должны быть верифицированы пользователем самостоятельно или в официально одобренной независимой лаборатории. Характеристики специализированных биологических индикаторов (см. подраздел 2.1.4. Специализированные биологические индикаторы) также должны быть верифицированы пользователем самостоятельно или в официально одобренной независимой лаборатории.

2.1.1. Инокулированные носители

Инокулированные носители представляют собой подходящий носитель, на или в который инокулирована определённая популяция бактериальных спор, помещённый, как правило, в защитную оболочку. Тип носителя (и оболочка, если она используется) может влиять на устойчивость бактериальных спор и должен быть совместим с выбранным процессом стерилизации (например, полоски фильтровальной бумаги в пергаминовых конвертах часто используют при стерилизации паром и этиленоксидом, в то время как металлические диски, упакованные в нетканые волокнистые конверты, используют при стерилизации парами перекиси водорода). После воздействия процесса стерилизации носитель обрабатывают подходящим образом в асептических условиях, переносят в подходящую питательную среду и инкубируют в течение достаточного периода времени при соответствующей температуре.

2.1.2. Автономные биологические индикаторы

Автономные биологические индикаторы представляют собой, например:

– систему, состоящую из инокулированного тест-микроорганизмом носителя и упаковки (например, ампулы) с питательной средой, подходящей для используемого тест-микроорганизма. Система спроектирована таким образом, что стерилизующий агент вступает в контакт с носителем, содержащим инокулированные тест-микроорганизмы (например, через глубинный или мембранный фильтр), а процесс стерилизации не оказывает неблагоприятного воздействия на ростовые свойства питательной среды. После стерилизации носитель приводят в контакт с питательной средой с помощью простой манипуляции. Данный тип биологической индикаторной системы используют для оценки процессов стерилизации влажным паром, включая подтверждение проникновения пара в систему;

– упаковку (например, ампулу), содержащую популяцию тест-микроорганизма в соответствующей питательной среде. После стерилизации упаковку инкубируют без дальнейших манипуляций. Данный тип биологического индикатора чувствителен только ко времени воздействия и температуре и может использоваться главным образом для контроля стерилизации жидкостей на основе воды. Для удобства и упрощения обнаружения роста тест-микроорганизмов питательная среда может содержать индикатор (например, рН-индикатор).

Автономные биологические индикаторы не подходят для валидации определённых процессов стерилизации.

2.1.3. Охарактеризованные суспензии спор

Охарактеризованные суспензии спор состоят из определённой популяции бактериальных спор, приготовленных из чётко охарактеризованного и подходящим образом поддерживаемого штамма спорообразующего бактериального вида (например, родов Bacillus или Clostridium) в стабильной суспензии.

2.1.4. Специализированные биологические индикаторы

Специализированные биологические индикаторы представляют собой тестовые изделия (например, резиновые пробки) или продукты, инокулированные подходящим тест-микроорганизмом, обычно из охарактеризованной суспензии спор или из суспензии спор, приготовленных из изолятов, полученных в результате мониторинга окружающей производственной среды или других микробиологических испытаний с использованием чётко определённой процедуры, разработанной для получения удовлетворительной споруляции. Необходимо определить D-значение (время, необходимое для снижения количества микроорганизмов на 90 %) и, при необходимости, z-значение (см. подраздел 3.1.1.Величина z) суспензии спор. Также значения величин D и z (если применимо) спор определяют для тест-предметов или продуктов, инокулированных тест-микроорганизмами, поскольку они могут отличаться от значений для спор в суспензии (подразделах Тест-микроорганизмы данной общей фармакопейной статьи).

По окончании цикла стерилизации биологический индикатор проверяют на наличие или отсутствие живых тест-микроорганизмов или проводят подсчёт живых тест-микроорганизмов с использованием подходящего валидированного микробиологического метода.

2.2. ТРЕБОВАНИЯ К КАЧЕСТВУ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ

При поставке каждой серии биологического индикатора пользователю должна быть представлена следующая информация:

– род и виды тест-микроорганизмов (включая номер коллекции типовых культур, если применимо);

– уникальный номер, по которому может быть восстановлена история изготовления (например, номер серии);

– количество жизнеспособных спор, выраженное с точностью до одного десятичного знака десятичного логарифма;

– используемый метод восстановления;

– тип носителя;

– тип упаковки (например, конверт);

– состав среды для восстановления, при необходимости (например, в случае автономных биологических индикаторов);

– тип индикатора роста (например, индикатор pH), если необходимо;

– тип процесса(ов) стерилизации и условия, для которых был охарактеризован биологический индикатор;

– устойчивость (величина D) для серии готового биологического индикатора к указанным процессам стерилизации в течение всего отмеченного срока годности; значение величины D должно быть указано в применимых единицах (например, время или доза) и выражаться с точностью до одного десятичного знака, вместе с 95-процентным доверительным интервалом, если это возможно;

– метод (кинетика инактивации или метод отрицательного дробления), используемый для определения устойчивости (значения D); параметры для проверки, например, условия воздействия, количество протестированных повторов, среда и условия инкубации, используемые для восстановления после воздействия и т. д.;

– z-значение (где применимо) для биологического индикатора, указанное в единицах температуры, выраженное с точностью до одного десятичного знака в экспоненциальном представлении, включая диапазон температур, используемый для определения z-значения;

– условия хранения и дата истечения срока годности.

2.2.1. Спецификация требований пользователя

Выбор биологического индикатора зависит от особенностей процесса стерилизации (влажный жар, сухой жар, газ или ионизирующее излучение). Выбор заключается в подборе штамма тест-микроорганизмов, типа биологического индикатора, значения величины D и исходного количества спор. Кроме того, испытуемый штамм должен быть более устойчив к конкретному методу стерилизации, чем микроорганизмы, потенциально контаминирующие продукт.

2.2.2. Контроль качества

Контроль качества биологических индикаторов заключается в проверке на чистоту и подлинность и оценке количества жизнеспособных клеток. Биологический индикатор должен соответствовать спецификациям требований пользователя. Пользователи, применяющие биологические индикаторы вне рекомендаций производителя, должны тщательно подбирать их по параметрам для конкретного процесса стерилизации.

Чистота. Исследование тест-микроорганизмов на подходящей питательной среде, инкубированных в соответствующих условиях, не должно выявлять никаких признаков контаминации посторонними микроорганизмами.

Идентификация. При необходимости проверяют морфологию колоний и однородность популяции.

Количество жизнеспособных микроорганизмов. Подсчёт жизнеспособных микроорганизмов производят в соответствии с инструкциями производителя или любым другим валидированным методом.

2.2.3. Пригодность

Необходимо убедиться, что биологический индикатор инактивирован до ожидаемой степени выживаемости микроорганизмов в подходящем диапазоне условий стерилизации.

3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССОВ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ

3.1. ПАРАМЕТРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИНДИКАТОРОВ ДЛЯ ТЕРМИЧЕСКОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ

3.1.1. Величина z

Процессы стерилизации проводят при температурах ниже стандартной 121 °С (при более длительном времени воздействия) или более высоких температурах (при более коротком времени воздействия). Величину z (разность температур, которая приводит к 10-кратному изменению значения величины D биологического индикатора) используют при сравнении эффективности двух циклов, работающих при разных температурах. Для определения величины z значение величины D должно быть определено при трёх или более значениях температуры. Предполагаемая температура процесса должна быть в пределах диапазона трёх значений температур. Строят график зависимости десятичного логарифма значения величины D от температуры, выраженной в градусах Цельсия. Величина z равна отрицательной обратной величине наклона кривой, построенной с помощью регрессионного анализа.

3.1.2. Установление цикла валидации

Характеристики процесса стерилизации (например, комбинация времени и температуры, требуемый уровень обеспечения стерильности или требуемая величина F₀) являются основой для выбора биологического индикатора (тип биологического индикатора, тест-микроорганизм и исходное количество жизнеспособных тест-микроорганизмов).

Инактивация тест-микроорганизмов в условиях стерилизации может быть описана кинетикой летальности с учётом статистических вероятностей. Для ряда биологических индикаторных единиц с исходной популяцией N₀ тест-микроорганизмов на единицу и заданным значением величины D время воздействия в минутах, когда на всех единицах, как ожидается, будут обнаруживаться выжившие микроорганизмы (в среднем 100 выживших спор на единицу) рассчитывают по формуле (1):

Время гибели (t_k) – время воздействия в минутах, в течение которого все единицы биологического индикатора ожидаемо должны быть инактивированы (в среднем 10⁴ выживших спор на единицу биологического индикатора), которое рассчитывают по формуле (2):

Целью валидации является подтверждение того, что эффективность стерилизации, ожидаемая от физических параметров процесса, эквивалентна биологической эффективности стерилизации. В рамках этой цели время экспозиции во время валидации  не должно превышать . Если выбрано слишком большое значение , даже относительно большое увеличение величины D приведёт к обнаружению биологических индикаторных единиц без выживших микроорганизмов. В этом случае не будут обнаружены неоптимальные условия стерилизации. Считают обоснованным выбрать  не выше, чем требуется для ожидаемого обнаружения 1 из 1000 единиц биологических индикаторов с выжившими тест-микроорганизмами. Однако не должно быть выбрано слишком малое значение . Если выбрать  таким образом, что 50 % единиц биологического индикатора будут содержать выжившие тест-микроорганизмы, изменения условий стерилизации (например, время, температура) всё еще могут привести к тому, что 100 % единиц биологического индикатора будут содержать выжившие тест-микроорганизмы, и испытание будет недействительным. По этим причинам значение  выбирают таким образом, чтобы ожидаемая теоретическая выживаемость тест-микроорганизмов находилась между 10^˗1 и 10^˗3, и рассчитывают по формуле (3):

Как правило, биологические индикаторы подвергаются предполагаемому процессу стерилизации, но для процессов стерилизации с избыточно высокой эффективностью расчётная эффективность цикла может быть такой, что значение  окажется значительно превышено. В таких случаях валидацию проводят с сокращёнными циклами стерилизации. Сокращённые циклы могут быть короче по времени (например, половина цикла) или при более низкой температуре. В последнем случае должны быть известны значения величины z для тест-микроорганизма при фактических условиях стерилизации. Сокращённый цикл выбирают так, чтобы температура была не более чем на одно значение величины z ниже контрольной температуры процесса стерилизации. Биологические индикаторы соответствующей устойчивости для этого цикла должны показывать ожидаемую выживаемость тест-микроорганизмов в диапазоне между нижним значением  и значением  (см. формулу (3)). Решение не проводить данное испытание должно быть обоснованным.

В зависимости от значения величины D тест-микроорганизма и выбранного значения  в биологических индикаторах содержание выживших тест-микроорганизмов можно ожидать с низкой частотой (не более 1 из 10). Установленный процесс может быть одобрен, если подтверждают, что частота обнаружения биологических индикаторов, содержащих выжившие тест-микроорганизмы, находится в пределах ожидаемого диапазона и не связана с неподходящими условиями стерилизации.

При валидации полного цикла стерилизации все биологические индикаторы должны быть инактивированы, что доказывает снижение количества тест-микроорганизмов не менее чем в 10⁶ раз. В этом случае, исходя из устойчивости используемых спор, можно сделать вывод, что процесс обеспечил достаточную летальность для достижения требуемого уровня стерильности.

3.2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА ПАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ (АВТОКЛАВИРОВАНИЯ)

3.2.1. Тест-микроорганизмы

Для оценки процесса паровой стерилизации наиболее широко используемыми биологическими индикаторными тест-микроорганизмами являются Geobacillus stearothermophilus. Указанные значения величины D_121 °С для спор в зависимости от условий споруляции, материала носителя, на который инокулированы споры, первичной упаковки, носителя с инокулированными спорами, и окружающей среды во время стерилизации находятся, как правило, в диапазоне от 1,5 мин до 4,5 мин.

Подходящими штаммами микроорганизмов являются АТСС 7953, NCTC 10007, CIP 52.81, NCIMB 8157 и АТСС 12980 (эквивалент NRRL В-4419). Могут быть использованы другие штаммы, если подтверждена эквивалентность их характеристик. Доказано, что популяция Geobacillus stearothermophilus в количестве 10⁵ или 10⁶ может не подходить для процессов стерилизации при значении F₀ от 8 до 15, поэтому может быть использовано меньшее число спор (10³ или 10⁴) или другие тест-микроорганизмы. Если используют тест-микроорганизмы, отличные от Geobacillus stearothermophilus (например, Bacillus subtilis АТСС 35021), с целью получения гарантии их пригодности для процесса оценивают их устойчивость.

3.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА СУХОЖАРОВОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Исходные условия указаны в ОФС «Методы обеспечения стерильности».

Теплопередача при использовании сухого жара менее эффективна, чем при использовании пара, и распределение температуры в стерилизаторах сухого тепла менее однородно по сравнению с паровыми стерилизаторами.

Как правило, биологические индикаторы, пригодные для стерилизации сухим жаром, имеют значение величины D_160 °С в диапазоне от одной минуты до пяти минут. При воздействии контрольного цикла продолжительностью два часа при температуре  160 °С биологический индикатор со значением величины D_160 °С, равным 2,5 мин, будет инактивирован на 48 единиц по шкале десятичного логарифма. Для процессов стерилизации сухим жаром при расчётах эквивалентности эффективности цикла (F_Н-расчёты) значение величины z обычно принимают около 20 °С. F_Н представляет собой эквивалентное время в минутах при температуре 160 °С, достигаемом в упакованном готовом продукте при его стерилизации. Для биологического индикатора со значением величины D_160 °С, равным пяти минутам, значение величины D_150 °С составит около 16 мин, инактивация в контрольном цикле – 7,5 единиц по шкале десятичного логарифма. Использование процесса стерилизации при температуре, сниженной от целевой на 10 °С по сравнению с заданной температурой, позволит получить ожидаемый показатель в 1 из 30 единиц биологического индикатора, содержащих выжившие микроорганизмы.

3.3.1. Тест-микроорганизмы

Для оценки процессов стерилизации сухим жаром, проводимых при температурах от 160 °С до 180 °С подходят споры Bacillus atrophaeus (например, АТСС 9372, NCIMB 8058, NRRL В-4418 или CIP 77.18). Если используют тест-микроорганизмы, отличные от Bacillus atrophaeus, для подтверждения пригодности оценивают их устойчивость к процессу стерилизации, как описано в подразделе Установление цикла валидации данной общей фармакопейной статьи.

4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА

СТЕРИЛИЗАЦИИ ГАЗОМ (ПАРОФАЗНОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ)

Для разработки валидации и мониторинга всех процессов газовой стерилизации необходимо использование биологических индикаторов. Газовая стерилизация является многофакторным процессом, где сложным образом взаимодействуют концентрация газа, влажность, температура, время и характеристики поверхности. Обычно в процессе газовой стерилизации используют этиленоксид, водорода пероксид и надуксусную кислоту или их комбинации.

Обеззараживание поверхности газом широко используют для медицинских приборов, изоляторов, камер и др.

4.1. ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМЫ

4.1.1. Стерилизация этиленоксидом

Для стерилизации этиленоксидом рекомендуется использование спор Bacillus atrophaeus (например, АТСС 9372, NCIMB 8058, NRRL В-4418 или CIP 77.18). Могут быть использованы другие штаммы, если подтверждена эквивалентность их характеристик. Количество жизнеспособных спор должно быть не менее 10⁶ на носитель. Величина D тест-микроорганизмов должна соответствовать процессу валидации. Данные биологические индикаторы обычно используют в рутинной практике в каждом цикле стерилизации, что позволяет контролировать эффективность процесса.

4.1.2. Другие процессы

Пользователь несёт ответственность за определение цикла стерилизации и пригодность любого используемого биологического индикатора. Geobacillus stearothermophilus был признан подходящим для процессов с использованием паров водорода пероксида.

5. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИНДИКАТОРЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОЦЕССА РАДИАЦИОННОЙ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Для валидации стерилизующей дозы радиационной стерилизации биологические индикаторы обычно не считаются необходимыми, если не указано иное. Однако использование биологических индикаторов может потребоваться для разработки и валидации стерилизации ионизирующим излучением, например, тканей, клеточных препаратов или других особых случаев (например, продуктов с потенциалом для защиты от спор).

5.1. ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМЫ

Рекомендуются к использованию споры Bacillus pumilus (например, АТСС 27142, NCTC 10327, NCIMB 10692 или CIP 77.25). Допускается использование других штаммов, если подтверждена эквивалентность их характеристик.

6. ПРЕПАРАТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ СТЕРИЛИЗУЮЩЕЙ ФИЛЬТРАЦИИ

Некоторые продукты, которые не могут быть стерилизованы в их конечной упаковке, возможно стерилизовать с помощью процесса фильтрации (ОФС «Методы обеспечения стерильности»). В отличие от биологических индикаторов, описанных в предыдущих разделах, которые оценивают стерилизацию на основе уничтожения, биологическое испытание оценивает удержание микроорганизмов фильтрами.

Для проверки процесса стерилизации должно быть показано, что процесс фильтрации (обычно в уменьшенной модели) способен полностью удерживать микробную нагрузку с использованием подходящего тест-микроорганизма не менее 10⁷ КОЕ на квадратный сантиметр эффективной поверхности фильтра. Это испытание должно максимально точно имитировать реальный процесс фильтрации. По возможности испытание проводят в продукте с использованием указанных условий фильтрации. Если это невозможно, например, из-за антимикробных свойств продукта, используют среду, максимально похожую на продукт.

6.1. ТЕСТ-МИКРООРГАНИЗМЫ

Для процессов, использующих систему фильтрации с номинальным размером пор не более 0,22 мкм, рекомендуют суспензию Brevundimonas diminuta (ATCC 19146, NCIMB 11091 или CIP 103020). Суспензию Brevundimonas diminuta готовят для достижения преимущественно одиночных клеток наименьшего возможного размера. Другие микроорганизмы, например, естественная флора, выделенная из стерилизуемого продукта или процесса, используют, если они представляют более сильную проблему для стерильной системы фильтрации, чем Brevundimonas diminuta. Для систем фильтрации с номинальным размером пор 0,1 мкм или менее, используют суспензию Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206).