ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

ФС.0.0.0000
БАЦИТРАЦИН ЦИНКА
Bacitracinum zincum
Bacitracin zinc
Бацитрацин	X	Y		R	Молекулярная формула
A	L-Ile	L-Ile		CH3	C66H103N17O16S
B1	L-Ile	L-Ile		H	C65H101N17O16S
B2	L-Val	L-Ile		CH3	C65H101N17O16S
B3	L-Ile	L-Val		CH3	C65H101N17O16S
[1405-89-6]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Цинковый комплекс бацитрацина, состоящий из смеси полипептидов, производимых штаммами Bacillus licheniformis или Bacillus subtilis, основными компонентами которой являются:

- 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин] (бацитрацин A);

- 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S)-1-амино-2-метилпропил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин] (бацитрацин B1);

- 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-валил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин] (бацитрацин B2);

- 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-валил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин] (бацитрацин B3).

Содержание: не менее 60 МЕ/мг в пересчёте на сухую субстанцию.

СВОЙСТВА

Описание. Белый или желтовато-серый порошок.

Гигроскопичен.

Растворимость. Мало растворим в воде и спирте 96 %.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Первая идентификация: Б, В.

Вторая идентификация: А, В.

А. Тонкослойная хроматография (ОФС «Тонкослойная хроматография»).

Испытуемый раствор. 10 мг испытуемого образца растворяют в 0,5 мл раствора хлористоводородной кислоты разведённой 7,3 % и доводят объём раствора водой до 1,0 мл.

Раствор сравнения. 10 мг фармакопейного стандартного образца бацитрацина цинка растворяют в 0,5 мл раствора хлористоводородной кислоты разведённой 7,3 % и доводят объём раствора водой до 1,0 мл.

Условия хроматографирования:

- ТСХ пластинка со слоем силикагеля;

- подвижная фаза: уксусная кислота ледяная – вода – бутанол (14:29:57 об/об/об);

- наносимый объём пробы: 10 мкл в виде точек;

- высушивание: при температуре 100–105 °С в течение 5 мин;

- детектирование: опрыскивание нингидрина раствором 1,7 % уксусно-спиртовым при нагревании до 110 °С в течение 5 мин.

Требование: на хроматограмме испытуемого раствора должна обнаруживаться основная зона адсорбции на уровне основной зоны адсорбции на хроматограмме раствора сравнения, соответствующее ему по величине и окраске.

Б. Жидкостная хроматография. Используют хроматограммы, полученные в испытании «Компонентный состав».

Требование: на хроматограмме испытуемого раствора времена удерживания пиков должны соответствовать временам удерживания пиков бацитрацина A, бацитрацина B1, бацитрацина B2, бацитрацина B3 на хроматограмме раствора сравнения (а).

В. Качественная реакция. Для определения сжигают 0,15 г испытуемого образца, дают остыть и растворяют остаток в 1 мл раствора хлористоводородной кислоты разведённой 7,3 % и прибавляют 4 мл воды.

К 5 мл полученного раствора прибавляют 0,2 мл натрия гидроксида раствора концентрированного, образуется белый осадок. К полученному осадку прибавляют 2 мл натрия гидроксида раствора концентрированного до растворения осадка. К полученному раствору прибавляют 10 мл аммония хлорида раствора 10,7 %, раствор должен оставаться прозрачным. К полученному раствору прибавляют 0,1 мл натрия сульфида раствора в глицерине; должен образоваться хлопьевидный белый осадок.

ИСПЫТАНИЯ

pH (ОФС «Ионометрия», метод 3). От 6,0 до 7,5.

1,0 г испытуемого образца растворяют в воде и доводят объём раствора тем же растворителем до 10 мл. Полученный раствор перемешивают в течение 10 мин.

Компонентный состав. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография»).

Все растворы готовят непосредственно перед использованием.

Раствор А. Раствор 40 г/л натрия эдетата доводят до pH 7,0 натрия гидроксида раствором 8,5 %.

Раствор Б. В мерной колбе растворяют 54,4 г калия дигидрофосфата в воде и доводят объём тем же растворителем до 2000 мл. Устанавливают pH полученного раствора до 6,0 при помощи раствора 34,8 г/л дикалия гидрофосфата и фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,45 мкм).

Испытуемый раствор. 0,100 г испытуемого образца растворяют в растворе А и доводят объём раствора тем же растворителем до 50,0 мл.

Раствор сравнения (а). 20 мг фармакопейного стандартного образца бацитрацина для определения пригодности хроматографической системы растворяют в растворе А и доводят объём раствора тем же растворителем до 10,0 мл.

Раствор сравнения (б). 5,0 мл раствора сравнения (а) разбавляют до 100,0 мл раствором А. 1,0 мл полученного раствора разбавляют раствором А до объёма 10,0 мл.

Раствор сравнения (в). Для получения примесей E, F, G и H, нагревают 4 мл раствора сравнения (а) в течение 30 мин на водяной бане. Полученный раствор используют после охлаждения.

Условия хроматографирования:

- колонка: длиной 0,15 м и внутренним диаметром 4,6 мм; заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии с размером частиц 3 мкм;

- температура колонки: 28±2 °С;

- подвижная фаза: ацетонитрил – раствор Б – вода – метанол (43:100:300:557 об/об/об/об);

- скорость потока подвижной фазы: 1,0 мл/мин;

- детектор: спектрофотометрический: длина волны, 254 нм;

- вводимый объём пробы: по 100 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения (а) и (б);

- время хроматографирования: должно в 3 раза превышать время удерживания бацитрацина A.

При необходимости корректируют состав подвижной фазы путём изменения количества органического компонента, сохраняя при этом соотношение между метанолом и ацетонитрилом.

Идентификация компонентов: для идентификации пиков компонентов бацитрацин A, бацитрацин B1, бацитрацин B2 и бацитрацин B3 и примеси M используют хроматограмму раствора сравнения (а) и относительное время удерживания соединений.

Относительное время удерживания (время удерживания бацитрацина А – около 20 мин): примесь A – около 0,44; примесь B – около 0,52; примесь C – около 0,55; бацитрацин B1 – около 0,65; бацитрацин B2 – около 0,67; бацитрацин B3 – около 0,81; примесь M – около 0,87; примесь N – около 0,90; примесь L – около 0,93; примесь O – около 1,2; примеси P и Q – около 1,3; примесь F – около 1,6; примесь G – около 1,8; примесь H – около 2,1; примесь E – около 2,8.

Пригодность хроматографической системы:

- отношение максимум/минимум (p/v): не менее 1,2, где H_p – высота пика компонента бацитрацина B2 относительно базовой линии и H_v – высота над базовой линией наиболее низкой точки кривой, разделяющей данный пик от пика бацитрацина B1 на хроматограмме раствора сравнения (а);

- отношение максимум/минимум (p/v): не менее 1,1, где H_p – высота пика примеси M относительно базовой линии и H_v – высота над базовой линией наиболее низкой точки кривой, разделяющей данный пик от пика бацитрацина B3 на хроматограмме раствора сравнения (а);

- отношение сигнал/шум (S/N) не менее 50 для пика компонента бацитрацин A на хроматограмме раствора сравнения (б).

Содержание каждого компонента бацитрацин A, бацитрацин B1, бацитрацин B2 и бацитрацин B3 в процентах вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»).

Пределы содержания компонентов:

- бацитрацин A – не менее 45,0 %;

- сумма бацитрацин B1, бацитрацин B2 и бацитрацин B3 – не менее 77,0 %.

- неучитываемый предел: не более 0,25 %.

Родственные примеси. Метод ВЭЖХ (ОФС «Высокоэффективная жидкостная хроматография») в условиях, описанных в испытании «Компонентный состав», со следующими изменениями:

Примечание

Примесь A (бацитрацин D1, бацитрацин C2): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S)-1-амино-2-метилпропил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-валил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь B (бацитрацин D2, бацитрацин C3): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S)-1-амино-2-метилпропил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-L-α-глутамил-L-валил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь C (бацитрацин D3, бацитрацин C1a): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-валил-L-лизил-D-орнитил-L-валил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь E (бацитрацин F): 4,10-ангидро[N-[[2-[(2S)-2-метил-1-оксобутил]-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь F (бацитрацин H1): 4,10-ангидро[N-[[2-(2-метил-1-оксопропил)-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь G (бацитрацин H2): 4,10-ангидро[N-[[2-[(2S)-2-метил-1-оксобутил]-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-валил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь H (бацитрацин H3): 4,10-ангидро[N-[[2-[(2S)-2-метил-1-оксобутил]-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-валил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь L (бацитрацин X): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1R,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь M (бацитрацин Y): 4,10-ангидро[N-[[2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь N (бацитрацин Z): 4,10-ангидро[N-[[(4S)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь O (бацитрацин J1): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-5-метилен-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь P (бацитрацин J2): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилбутил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-5-метилен-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

Примесь Q (бацитрацин J3): 4,10-ангидро[N-[[(4R)-2-[(1S,2S)-1-амино-2-метилпент-4-ен-1-ил]-4,5-дигидро-1,3-тиазол-4-ил]карбонил]-L-лейцил-D-α-глутамил-L-изолейцил-L-лизил-D-орнитил-L-изолейцил-D-фенилаланил-L-гистидил-D-α-аспартил-L-аспарагин].

- вводимый объём пробы: по 100 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения (а), (б) и (в);

Идентификация примесей: для идентификации пиков примесей A, B, C, L, M, N, O, P и Q используют хроматограмму раствора сравнения (а), для примесей E, F, G и H используют хроматограмму раствора сравнения (в).

Содержание родственных примесей вычисляют согласно методу нормирования (ОФС «Хроматография»).

Пределы содержания примесей:

- сумма примесей L и N: не более 8,0 %;

- примесь E: не более 4,0 %;

- примесь A: не более 3,5 %;

- примеси B и M: для каждой примеси, не более 3,0 %;

- примесь С: не более 2,5 %;

- сумма примесей O, P и Q: не более 2,5 %;

- сумма примесей F и G: не более 2,0 %;

- примесь H: не более 1,0 %;

- любые примеси: для каждой примеси, не более 2,0 %;

- сумма примесей: не более 23,0 %;

- неучитываемый предел: не более 0,25 %.

Остаточные органические растворители (ОФС «Остаточные органические растворители»).

Цинк. От 3,5 % до 5,5 %, в пересчёте на сухую субстанцию.

0,200 г испытуемого образца растворяют в смеси 2,5 мл уксусной кислоты разведённой 12 % и 2,5 мл воды, прибавляют 50,0 мг ксиленолового оранжевого, 50 мл воды и гексаметилентетрамин до изменения окраски на красную. К полученному раствору прибавляют 2 г гексаметилентетрамина в избытке. Полученный раствор титруют 0,01 М раствором натрия эдетата до появления жёлтого окрашивания.

1 мл 0,01 М раствор натрия эдетата эквивалентен 0,654 мг Zn.

Потеря в массе при высушивании (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 2). Не более 5,0 %.

1,000 г испытуемого образца высушивают в глубоком вакууме при температуре 60 °С в течение 3 ч.

Микробиологическая чистота. Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на микробиологическую чистоту.

Испытание проводят для нестерильных субстанций.

Стерильность (ОФС «Стерильность»). Испытуемый образец должен выдерживать требования испытания на стерильность.

Испытание проводят для стерильных субстанций.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Микробиологический метод (ОФС «Определение антимикробной активности антибиотиков»).

ХРАНЕНИЕ

В воздухонепроницаемой упаковке.

Если субстанция стерильная, её хранят в стерильной герметичной упаковке с контролем первого вскрытия.