Определение состава жирных кислот методом газовой хроматографии

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Испытание на посторонние масла проводят на метиловых эфирах жирных кислот, содержащихся в масле, которые определяют методом газовой хроматографии (ОФС «Газовая хроматография»).

МЕТОДИКА 1

Методика не применима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми или циклопропениловыми группами, или для масел, в составе которых большая часть жирных кислот имеет длину цепи менее восьми атомов углерода, или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. Испытуемое масло высушивают перед метилированием, если это указано в фармакопейной статье. Взвешивают 1,0 г масла, помещают в круглодонную колбу вместимостью 25 мл со шлифом, снабжённую обратным холодильником и трубкой для подачи газа. Прибавляют 10 мл метанола безводного Р и 0,2 мл 60 г/л раствора калия гидроксида Р в метаноле Р. Присоединяют обратный холодильник и, пропускают через полученную смесь азот Р со скоростью около 50 мл/мин, встряхивают и нагревают до кипения. Когда раствор станет прозрачным (обычно через 10 мин), продолжают нагревание в течение последующих 5 мин. Колбу охлаждают под проточной водой и содержимое переносят в делительную воронку. Колбу промывают 5 мл гептана Р, переносят промывные воды в ту же делительную воронку и встряхивают. Прибавляют 10 мл 200 г/л раствора натрия хлорида Р и энергично встряхивают. Оставляют до расслоения и переносят органический слой в ёмкость, содержащую натрия сульфат безводный Р. Выдерживают и затем фильтруют.

Раствор сравнения (а). Готовят 0,50 г смеси калибровочных веществ с составом, описанным в одной из приведённых ниже таблиц, как указано в фармакопейной статье (если в фармакопейной статье не указан определённый раствор, готовят смесь, состав которой приведён в таблице 1). Растворяют в гептане Р и доводят объём раствора тем же растворителем до 50,0 мл.

Раствор сравнения (б). 1,0 мл раствора сравнения (а) доводят гептаном Р до 10,0 мл.

Раствор сравнения (в). Готовят 0,50 г смеси метиловых эфиров жирных кислот, которые по составу соответствуют смеси жирных кислот, указанных в фармакопейной статье на испытуемое вещество. Растворяют в гептане Р и доводят объём раствора тем же растворителем до 50,0 мл. Также могут быть использованы готовые смеси метиловых эфиров жирных кислот.

Условия хроматографирования:

– колонка: из плавленого кварца, стекла или кварца длиной от 10 м до 30 м и внутренним диаметром от 0,2 мм до 0,8 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 Р (толщиной от 0,1 мкм до 0,5 мкм) или другой подходящей неподвижной фазой;

– газ-носитель: гелий для хроматографии Р или водород для хроматографии Р;

– скорость газа-носителя: 1,3 мл/мин (для колонки с внутренним диаметром 0,32 мм);

– деление потока: 1:100 или менее, в зависимости от внутреннего диаметра колонки (для колонки с внутренним диаметром 0,32 мм – 1:50).

– температура:

– колонки в изотермических условиях – от 160 °C до 200 °C в зависимости от длины и типа колонки (200 °C для колонки длиной 30 м, покрытой слоем макрогола 20 000 Р); например, при необходимости использования программы линейного градиента температуры, повышают температуру от 170 °C до 230 °C со скоростью 3 °C/мин;

– блока ввода проб и детектора: 250 °C;

– детектор: пламенно-ионизационный;

– объём вводимой пробы: 1 мкл.

Пригодность хроматографической системы при использовании смеси калибровочных веществ в соответствии с таблицей 1 или таблицей 3:

– разрешение (R_S): не менее 1,8 между пиками метилолеата и метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения (а);

– отношение «сигнал/шум»: не менее 5 для пика метилмиристата на хроматограмме раствора сравнения (б);

– число теоретических тарелок: не менее 30 000, рассчитанных по пику метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения (а).

Пригодность хроматографической системы при использовании смеси калибровочных веществ в соответствии с таблицей 2:

– разрешение (R_S): не менее 4,0 между пиками метилкаприлата и метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения (а);

– отношение «сигнал/шум»: не менее 5 для пика метилкапроата на хроматограмме раствора сравнения (б);

– число теоретических тарелок: не менее 15 000, рассчитанных по пику метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения (а).

ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММ

Следует избегать условий хроматографирования, которые могут дать неразделённые пики (наличие компонентов с небольшим различием между временами удерживания, например, линоленовая и арахиновая кислоты).

Качественный анализ. Идентифицируют пики, полученные на хроматограмме раствора сравнения (в) (изотермические условия работы или линейное программирование температуры).

При использовании изотермических условий, пики могут быть идентифицированы при построении калибровочных графиков, используя хроматограмму раствора сравнения (а) и информацию, приведённую в таблицах 1, 2, 3.

Таблица 1 – Смесь калибровочных веществ (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока рекомендуется, чтобы при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь добавлялся компонент испытуемой смеси с максимальным числом атомов углерода в цепи)

Таблица 2 – Смесь калибровочных веществ (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока рекомендуется, чтобы при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь добавлялся компонент испытуемой смеси с максимальным числом атомов углерода в цепи)

Таблица 3 – Смесь калибровочных веществ (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и системой с делением потока рекомендуется, чтобы при выполнении качественного анализа с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь добавлялся компонент испытуемой смеси с максимальным числом атомов углерода в цепи)

На хроматограмме раствора сравнения (а) измеряют приведённое время удерживания (tʹ_R) каждого пика.

tʹ_R – от времени выхода пика растворителя, а не от времени ввода пробы.

Строят график линейной зависимости:

log₁₀ (tʹ_R) = f (эквивалент длины цепи)

Логарифмы tʹ_R ненасыщенных кислот расположены на этой линии в точках, соответствующих нецелым значениям «эквивалент длины цепи»; эквивалент числа атомов углерода в цепи представляет собой длину теоретически насыщенной цепи, которая будет иметь такое же приведённое время удерживания (tʹ_R) как идентифицируемая жирная кислота. Например, линолевая кислота имеет такое же tʹ_R как и теоретически насыщенная жирная кислота, имеющая 18,8 атомов углерода.

Идентификацию пиков на хроматограмме испытуемого раствора проводят по прямой линии и по приведённым временам удерживания. Эквиваленты длины цепи приведены в таблице 4.

Таблица 4 – Эквиваленты длины цепи (эти значения, вычисленные с использованием калибровочных кривых, приведены в качестве примера для колонки с макроголом 20 000 Р)

Количественный анализ. В основном используют метод внутренней нормализации, при этом сумму площадей пиков на хроматограмме, кроме пиков, относящихся к растворителю, принимают за 100 %. Содержание компонента вычисляют как отношение площади соответствующего пика к сумме площадей всех пиков. Не учитывают любые пики, площадь которых составляет менее 0,05 % от суммы площадей.

В определённых случаях, например, при наличии жирных кислот
с 12 или менее атомами углерода, в фармакопейной статье должны быть указаны поправочные коэффициенты для преобразования площадей пиков в проценты (м/м).

МЕТОДИКА 2

Методика неприменима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. Помещают 0,100 г испытуемого образца в центрифужную пробирку объёмом 10 мл с завинчивающейся крышкой.

Растворяют в 1 мл гептана Р и 1 мл диметилкарбоната Р и энергично перемешивают при слабом нагревании (от 50 ºС до 60 ºС). Прибавляют к ещё тёплому раствору 1 мл 12 г/л раствора натрия Р в метаноле безводном Р, приготовленного с соблюдением необходимых мер предосторожности, и энергично перемешивают в течение 5 мин. Прибавляют 3 мл воды дистиллированной Р и энергично перемешивают в течение 30 с. Центрифугируют при 1500 g в течение 15 мин. Вводят 1 мкл органического слоя.

Раствор сравнения и оценка хроматограмм. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в разделе Методика 1.

Условия хроматографирования:

– колонка: из плавленого кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 Р (толщиной 0,25 мкм);

– газ-носитель: гелий для хроматографии Р;

– скорость газа-носителя: 0,9 мл/мин;

– деление потока: 1:100;

– режим изменения температуры:

– детектор: пламенно-ионизационный;

– объём вводимой пробы: 1 мкл.

МЕТОДИКА 3

Методика неприменима для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, альдегидными, кетоновыми, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами и сопряжёнными полиненасыщенными и ацетиленовыми соединениями из-за частичного или полного разрушения этих групп.

Испытуемый раствор. Растворяют 0,10 г испытуемого образца в 2 мл 20 г/л раствора натрия гидроксида Р в метаноле Р в конической колбе вместимостью 25 мл и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. Прибавляют через холодильник 2,0 мл бора трифторида раствора в метаноле Р и кипятят в течение 30 мин. Прибавляют 4 мл гептана Р через холодильник и кипятят в течение 5 мин. Охлаждают и прибавляют 10,0 мл натрия хлорида насыщенного раствора Р, встряхивают в течение 15 с и прибавляют такое количество натрия хлорида насыщенного раствора Р, чтобы верхний слой поднялся к горлу колбы. Отбирают 2 мл верхнего слоя, промывают тремя порциями воды Р, каждая по 2 мл, и сушат над натрия сульфатом безводным Р.

Растворы сравнения, хроматографическая методика и оценка хроматограмм. Если в фармакопейной статье нет других указаний, поступают, как указано в разделе Методика 1.