Определение сиаловой кислоты в полисахаридных вакцинах

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

В общей фармакопейной статье приведена методика определения сиаловой кислоты в полисахаридных вакцинах методом спектрофотометрии.

Испытуемый раствор. В мерной колбе подходящего объёма готовят раствор с концентрацией сухого полисахарида около 250 мг/мл используя воду, при необходимости объединяют содержимое одной или нескольких упаковок. Переносят с помощью шприца 4,0 мл полученного раствора в ультрафильтрационную ячейку вместимостью 10 мл, пропускающую молекулы с относительной молекулярной массой менее 50 000. Дважды промывают шприц водой, промывную жидкость переносят в ту же ультрафильтрационную ячейку. Проводят ультрафильтрацию при постоянном перемешивании в присутствии азота под давлением около 150 кПa. Наполняют ячейку водой каждый раз, когда объём жидкости в ней уменьшается до 1 мл, до тех пор, пока не профильтруется 200 мл, а оставшийся в ячейке объём не будет составлять около 2 мл. Оставшуюся жидкость переносят с помощью шприца в мерную колбу вместимостью 10 мл. Ячейку трижды промывают водой порциями по 2 мл. Промывную жидкость переносят в ту же мерную колбу и доводят водой до
объёма 10,0 мл (испытуемый раствор). В две пробирки помещают по 2,0 мл испытуемого раствора.

Растворы сравнения. Используют растворы сравнения, указанные в фармакопейной статье.

Готовят 2 серии из трёх пробирок. В пробирки каждой серии помещают 0,5 мл, 1,0 мл и 1,5 мл раствора сравнения, соответствующего типу вакцины, предназначенной для испытания, и объём в каждой пробирке доводят водой до 2,0 мл.

Контрольный раствор. Готовят с использованием воды по 2,0 мл в двух пробирках.

В каждую пробирку прибавляют по 5,0 мл резорцина реактива.

Пробирки нагревают при температуре 105 °С в течение 15 мин, охлаждают в холодной воде и помещают в ледяную баню. В пробирки прибавляют по 5 мл изоамилового спирта, содержимое тщательно перемешивают и выдерживают в ледяной бане 15 мин. Пробирки центрифугируют и держат их в ледяной бане до проведения измерения.

Измеряют оптическую плотность (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях») надосадочной жидкости при 580 нм и 450 нм, используя изоамиловый спирт в качестве компенсационного раствора.

Для каждой длины волны рассчитывают среднее из значений оптической плотности, полученных для двух идентичных растворов. Вычитают среднее значение оптической плотности контрольного раствора из среднего значения оптической плотности испытуемого раствора и растворов сравнения.

Строят калибровочный график зависимости разницы между значениями оптической плотности при 580 нм и 450 нм растворов сравнения от содержания сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты) и с его помощью определяют концентрацию сиаловой кислоты в испытуемом растворе.