Определение протеина С человека

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

В общей фармакопейной статье приведены методики количественного определения протеина С человека (протеин С) хромогенным методом в конечной точке (метод 1) и клоттинговым методом (метод 2).

МЕТОД 1. ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД

Протеин С представляет собой витамин К-зависимый белок плазмы человека, который после активации (активированный протеин С) подавляет свёртывание крови путём протеолитического расщепления факторов свёртывания крови Vа и VIIIа. Активность протеина С определяют с помощью двухстадийного метода:

- на первой стадии протеин С в образце активируют специфическим активатором, выделенным из яда змеи;

- на второй стадии активированный протеин С расщепляет специфический хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта (хромофора), который может быть количественно определён методом спектрофотометрии (рисунок 1).

Стадия 1

                         протеин С               активатор протеина С          активированный протеин С 

Стадия 2

хромогенный субстрат            активированный протеин С                  пептид + хромофор

Рисунок 1 – Схема количественного определения протеина С
хромогенным методом

Количественное определение протеина С основано на его способности расщеплять хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта и оценивается путём сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах (МЕ).

За международную единицу принимают активность определённого количества международного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной организацией здравоохранения.

Реактивы для испытания могут быть приобретены по отдельности или в виде наборов. Для количественного определения протеина С применяют как метод определения в конечной точке, так и кинетический метод. Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придерживаться инструкции производителя набора.

РЕАКТИВЫ

Буферный раствор для разведения с рH 8,4. Растворяют 6,055 г трис(гидроксиметил)аминометана и 16,84 г цезия хлорида в воде. Если необходимо, доводят pH хлористоводородной кислотой до 8,4 (ОФС «Ионометрия», метод 3) и доводят объём раствора водой до 1000 мл.

Активатор протеина С. Белок, специфично активирующий протеин С, выделяют из яда гадюки Agkistrodon contortrix. Восстанавливают и хранят в соответствии с инструкцией производителя. Перед использованием в испытании разводят водой до концентрации 0,25 ЕД/мл.

Хромогенный субстрат для активированного протеина С. Специфический хромогенный субстрат для активированного протеина С, например, L-пироглутамил-L-пролил-L-аргинин-4-нитроанилида гидрохлорид (пироGlu-Pro-Arg-pNA·HCl), растворяют в воде и доводят водой до получения концентрации 4,5 ммоль/л. Перед использованием разводят буферным раствором для разведения с pH 8,4 до концентрации 1,1 ммоль/л.

МЕТОДИКА

Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по медицинскому применению. Готовят с использованием воды не менее трёх отдельных разведений с концентрациями в диапазоне
0,050–0,200 МЕ/мл в двух повторностях. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца.

Стадия 1. Смешивают по 0,025 мл каждого разведения с 0,05 мл активатора протеина С, предварительно нагретых до температуры 37 °C, и инкубируют при той же температуре точно 10 мин. Для каждого разведения проводят контрольный опыт, используя воду вместо активатора протеина С.

Стадия 2. К каждой смеси прибавляют по 0,150 мл разбавленного хромогенного субстрата, предварительно нагретого до температуры 37 °C, и инкубируют при той же температуре точно 10 мин. При необходимости время инкубации должно быть скорректировано таким образом, чтобы получить линейную зависимость образования хромофора от времени. Останавливают реакцию добавлением 0,050 мл уксусной кислоты разведённой 50 %.

При расщеплении хромогенного субстрата под действием активированного протеина С образуется окрашенный продукт в количестве, пропорциональном концентрации протеина С в образце. Измеряют оптическую плотность при длине волны 405 нм (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»). Значение оптической плотности контрольного опыта вычитают из значения оптической плотности испытуемого образца и стандартного образца.

Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина С в испытуемом образце с использованием общепринятых статистических методов (ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами»).

МЕТОД 2. КЛОТТИНГОВЫЙ МЕТОД

Активность протеина С устанавливают после расщепления его до активированного протеина С специфическим активатором, выделенным из яда гадюки Agkistrodon contortrix. Полученный активированный протеин С инактивирует факторы свёртывания крови Va и VIIIa и таким образом удлиняет активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) системы, в которой присутствуют все факторы свёртывания на постоянном избыточном уровне, за исключением протеина С, поступающего в систему с добавляемым образцом. Увеличение времени свёртывания пропорционально концентрации протеина С в образце.

Количественное определение протеина С основано на его способности увеличивать время свёртывания и оценивается путём сравнения активности испытуемого образца с активностью стандартного образца протеина С, выраженной в международных единицах.

За международную единицу принимают активность определённого количества международного стандартного образца протеина С человека, устанавливаемую Всемирной организацией здравоохранения.

Реактивы для испытания могут быть приобретены по отдельности или в виде наборов.

Методики и реактивы могут отличаться в разных наборах, поэтому следует придерживаться инструкции производителя набора.

РЕАКТИВЫ

Буферный раствор для разведения с pH 7,4. Изотонический буферный раствор, не содержащий хелатирующих соединений.

Плазма крови человека, дефицитная по протеину С. Цитратная плазма крови человека, содержащая протеин С ниже определяемого уровня. Восстанавливают и хранят в соответствии с инструкцией производителя.

Активатор протеина С. Белок, специфично активирующий протеин С, выделяют из яда гадюки Agkistrodon contortrix. Восстанавливают и хранят в соответствии с инструкцией производителя.

Активатор свёртывания. Используют подходящий реактив для АЧТВ, содержащий фосфолипиды и контактный активатор. Активатор свёртывания может быть комбинирован с активатором протеина С.

МЕТОДИКА

Испытуемый образец восстанавливают или размораживают согласно инструкции по медицинскому применению. Готовят с использованием буферного раствора для разведения с pH 7,4 не менее трёх отдельных разведений с концентрациями в диапазоне 0,010–0,150 МЕ/мл в двух повторностях. Аналогичным образом готовят разведения восстановленного стандартного образца.

Смешивают один объём каждого разведения с одним объёмом плазмы крови человека, дефицитной по протеину С, и одним объёмом активатора протеина С (при необходимости объединённого с реактивом для АЧТВ). Все растворы должны быть предварительно нагреты до температуры 37 °C. Прибавляют один объём раствора 3,7 г/л кальция хлорида дигидрата, предварительно нагретого до температуры 37 °C, и регистрируют время свёртывания.

Время свёртывания пропорционально концентрации протеина С в каждом разведении.

Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность протеина С в испытуемом образце с использованием общепринятых статистических методов (ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами»).