Определение ингибитора α- 1-протеиназы человека

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

В общей фармакопейной статье приведена методика количественного определения ингибитора α-1-протеиназы человека (ингибитор
α-1-протеиназы), известного как α-1-антитрипсин или α-1-антипротеиназа, хромогенным методом.

Методика основана на сравнении испытуемого образца со стандартным образцом ингибитора α-1-протеиназы человека, калиброванного в миллиграммах активного (функционального) ингибитора α-1-протеиназы, по способности инактивировать сериновую протеазу – эластазу (свиную панкреатическую эластазу или эластазу нейтрофилов человека). Различные количества образца смешивают с заданным количеством эластазы, остаточную активность эластазы измеряют с использованием подходящего хромогенного субстрата.

ХРОМОГЕННЫЙ МЕТОД

РЕАКТИВЫ

Трис-альбуминовый буферный раствор. Растворяют 24,23 г трис(гидроксиметил)аминометана в воде, доводят рН до значения 8,0±0,3 (ОФС «Ионометрия», метод 3) раствором 250 г/л хлористоводородной кислоты, и доводят водой до объёма 1000 мл. К 100 мл полученного раствора прибавляют 0,5 мл раствора 200 г/л альбумина человека или альбумина бычьего.

Буферный раствор, содержащий альбумин человека или альбумин бычий, должен быть приготовлен в день его использования; в противном случае, раствор стерилизуют фильтрацией (0,2 мкм) и хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение двух недель.

МЕТОДИКА

Готовят в двух повторностях четыре или пять разведений испытуемого образца и стандартного образца в подходящем диапазоне концентраций ингибитора α-1-протеиназы, используя трис-альбуминовый буферный раствор.

В лунки микропланшета помещают по 50 мкл разведений стандартного образца или разведений испытуемого образца, затем в каждую лунку прибавляют по 150 мкл раствора свиной панкреатической эластазы (эластаза), разведённой до необходимой концентрации трис-альбуминовым буферным раствором. Инкубируют в течение определённого промежутка времени (3–10 мин) при комнатной температуре. Поскольку активность различных эластаз может варьировать, для получения подходящих изменений оптической плотности при длине волны 405 нм в данных конкретных условиях проведения испытания, концентрация эластазы может быть уточнена путём оценки активности в контрольных лунках, содержащих эластазу без ингибитора α-1-протеиназы.

В каждую лунку прибавляют по 100 мкл раствора хромогенного субстрата N-Сукцинил-L-аланил-L-аланил-L-аланила-4-нитроанилида (Suc-Ala-Ala-Ala-pNA) (раствор 4,5 мг/мл хромогенного субстрата в диметилсульфоксиде, разведённый трис-альбуминовым буферным раствором до рабочей концентрации 0,45 мг/мл). Измерение оптической плотности (ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях») начинают сразу же и проводят в течение 5 мин и более при длине волны 405 нм, используя спектрофотометр микропланшетный. Рассчитывают скорость изменения оптической плотности (ΔА/мин).

В качестве альтернативы возможно определение в конечной точке, останавливая реакцию уксусной кислотой и измеряя оптическую плотность при длине волны 405 нм. Если испытание выполняют в пробирках и для измерения оптической плотности используют спектрофотометр, пропорционально изменяют объёмы растворов реактивов.

Скорость изменения оптической плотности (ΔА/мин) обратно пропорциональна активности ингибитора α-1-протеиназы.

Проверяют достоверность результатов испытания и рассчитывают активность ингибитора α-1-протеиназы в испытуемом образце общепринятыми статистическими методами (ОФС «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами»).